維羅非尼聯(lián)合愛必妥對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的作用研究

馬 瑞， 徐 玲， 曲秀娟， 車曉芳， 郭天舒， 劉云鵬

(中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001)

維羅非尼聯(lián)合愛必妥對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的作用研究

馬 瑞， 徐 玲， 曲秀娟， 車曉芳， 郭天舒， 劉云鵬*

(中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001)

探討B(tài)RAF抑制劑維羅非尼聯(lián)合EGFR單克隆抗體西妥昔單抗對(duì)BRAF突變型和野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株的作用。應(yīng)用MTT法檢測(cè)，將不同濃度西妥昔單抗、維羅非尼單藥以及兩藥聯(lián)合分別作用于BRAF突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO、HT-29和BRAF野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株DIFI、CACO-2后，觀察各細(xì)胞株增殖變化；通過集落形成實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞驗(yàn)證不同處理因素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGFR下游通路靶蛋白的活性在兩藥聯(lián)合后是否出現(xiàn)明顯下調(diào)。結(jié)果顯示，單藥治療，西妥昔單抗能一定程度抑制BRAF野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株增殖，抑制率達(dá)26%～40%，而BRAF突變組兩種細(xì)胞株對(duì)西妥昔單抗均耐藥。維羅非尼對(duì)不同基因狀態(tài)細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，IC50均小于7 μmol/mL，其中BRAF突變細(xì)胞更為敏感。對(duì)比單藥西妥昔單抗，聯(lián)合維羅非尼后更加明顯地抑制了細(xì)胞增殖，4種細(xì)胞存活率均明顯降低(P<0.05)。長(zhǎng)時(shí)間集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩藥聯(lián)合形成集落的面積和數(shù)量均明顯減少。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)比單藥，兩藥聯(lián)合明顯下調(diào)了p-EGFR、BRAF、p-ERK的表達(dá)。結(jié)果顯示，BRAF抑制劑維羅非尼無論在BRAF突變型還是野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，均能增強(qiáng)西妥昔單抗作用的敏感性。

西妥昔單抗；維羅非尼；EGFR;BRAF;結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，統(tǒng)計(jì)顯示，目前結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均居各種常見惡性腫瘤前列。研究表明，CRC在發(fā)生、發(fā)展過程中與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)，其中表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)介導(dǎo)的通路尤為重要。EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，廣泛分布于人體各種組織器官的細(xì)胞中。與配體結(jié)合可引起其異常激活，從而引起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成[1]。EGRR單克隆抗體，西妥昔單抗(愛必妥，Cetuximab)通過作用于EGFR胞外區(qū)抗體位點(diǎn)干擾二聚體形成，進(jìn)而誘導(dǎo)受體內(nèi)化及下調(diào)。其主要功能是阻斷EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減低酪氨酸激酶的活性，從而抑制腫瘤的存活、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。愛必妥還可以發(fā)揮免疫抗腫瘤的作用，其激發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷作用，通過介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)靶向殺傷表達(dá) EGFR 的腫瘤細(xì)胞[3]。 ADCC 作用指表達(dá)IgG Fc受體的靶細(xì)胞膜抗原與已結(jié)合在腫瘤細(xì)胞表面的特異性 IgG 類抗體結(jié)合后，通過抗體Fc段構(gòu)象的改變與效應(yīng)細(xì)胞表面的FcγR結(jié)合，活化效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)而觸發(fā)其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。但愛必妥單藥治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)的有效率十分有限，僅為8%～13%[4]，即使與mCRC的主要化療方案FOLFOX、FOLFIRI聯(lián)合用藥，有效率較常規(guī)化療方案也僅提高8%～16%[5]。導(dǎo)致愛必妥敏感性不高的重要原因是耐藥發(fā)生。RAS基因突變(KRAS、NRAS、HRAS)是目前公認(rèn)的原發(fā)性耐藥機(jī)制。而有些RAS野生型患者仍對(duì)愛必妥耐藥，對(duì)RAS的下游信號(hào)進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，約有10%的mCRC患者伴有鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1基因(v-Rafmurine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)突變。BRAF蛋白激酶是有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路上重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其涉及到多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程[6]。現(xiàn)已于多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了BRAF基因的突變，包括惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、毛細(xì)胞白血病等。研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變發(fā)生率最高的是V600E 的突變，有90%以上腫瘤為此類突變。目前尚未開展過評(píng)價(jià)BRAF突變狀態(tài)與抗EGFR治療關(guān)系的隨機(jī)臨床試驗(yàn)，然而越來越多臨床研究的亞組分析顯示，BRAF突變的mCRC患者比BRAF野生型者對(duì)愛必妥的反應(yīng)更低，無疾病進(jìn)展生存期 (PFS) 和總生存期 (OS) 更短，疾病控制率也不理想[7]。近期研制的小分子TKI類靶向藥物維羅非尼，特異性地與BRAF V600E相結(jié)合，通過封閉下游通路抵抗腫瘤細(xì)胞的增殖，其在EGFR低表達(dá)的黑色素瘤的療效較好。目前維羅非尼已被FDA批準(zhǔn)治療晚期惡性黑色素瘤患者，然而其在同樣含有BRAF突變的結(jié)直腸癌治療中收效甚微，反應(yīng)率僅為5%左右[8]。目前認(rèn)為維羅非尼作用于EGFR表達(dá)水平較高的CRC細(xì)胞則會(huì)反饋性激活EGFR進(jìn)而激活下游的RAS及CRAF，而對(duì)其產(chǎn)生原發(fā)耐藥。目前無論臨床實(shí)驗(yàn)還是基礎(chǔ)研究均顯示，對(duì)BRAF突變的mCRC患者應(yīng)用愛必妥或帕尼單抗聯(lián)合維羅非尼治療可提高療效[9-10]。而維羅非尼在BRAF野生型患者的治療中扮演怎樣的角色,是否可以通過與愛必妥聯(lián)合作用加強(qiáng)抗腫瘤效果尚無明確報(bào)道。為了探討維羅非尼是否能夠通過聯(lián)合用藥提高愛必妥對(duì)結(jié)直腸癌治療的敏感性及其機(jī)制，本研究將單藥愛必妥、單藥維羅非尼及兩藥聯(lián)合作用于結(jié)直腸癌BRAF突變及野生型細(xì)胞株中，探討聯(lián)合用藥效果、作用機(jī)制，以及對(duì)EGFR/RAF/RAS/ERK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO、HT-29為BRAFV600E突變型、KRAS野生型細(xì)胞，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株DIFI、CACO-2為BRAF、KRAS野生型細(xì)胞，以上細(xì)胞株均購自中國科學(xué)研究院。愛必妥購自EMD Millipore公司(Billerica, MA, USA)，維羅非尼購自Selleck公司，兔抗人p-EGFR、p-ERK、BRAF抗體購自Cell Signaling公司，兔抗人EGFR、ERK 和β-actin 抗體購自 Santa Cruz 公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RKO、HT-29、DIFI和CACO-2為常規(guī)傳代培養(yǎng)，用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 U/mL)的RPMI-1640，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2～3 d傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后換液，分別加入一定濃度的愛必妥和/或維羅非尼，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL。分別培養(yǎng)48 h和72 h后每孔加入MTT 溶液20 μL，孵育4 h后棄上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩搖勻。最后測(cè)定吸光度并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3 集落形成實(shí)驗(yàn) 將增殖活躍特定數(shù)量的4種結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于12孔板上(500個(gè)/孔)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后先加入維羅非尼(2 μmol/mL)，1 h后加入愛必妥(10 μg/mL)。細(xì)胞培養(yǎng)14 d后棄上清，采用瑞氏-吉姆薩法進(jìn)行染色，并采用象限計(jì)數(shù)的方法計(jì)算細(xì)胞集落數(shù)量。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)蛋白變化 收集細(xì)胞，PBS洗2次后加入1% Triton裂解液，冰上裂解5 min，高速離心(13 000 r/min) 25 min，棄沉淀，進(jìn)行蛋白定量。在樣品中加入3×buffer并相互混合，放入煮樣器煮沸5 min，進(jìn)行蛋白電泳和轉(zhuǎn)印，之后牛奶封閉1 h。加入p-EGFR、EGFR、BRAF、ERK、p-ERK及β-actin的一抗，4 ℃孵育過夜。1×TTBS洗10 min×4次后，二抗(1∶ 2 000)室溫封閉30 min，1×TTBS再洗10 min×4次后，采用ECL法顯色，并分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 愛必妥對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株增殖的影響

0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL愛必妥分別作用于BRAF突變型和野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞 48和72 h 后，應(yīng)用 MTT 方法檢測(cè)愛必妥對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示愛必妥作用于BRAF突變型細(xì)胞幾乎不能引起細(xì)胞死亡，細(xì)胞的存活率均不低于80%(圖1)。提示BRAF突變結(jié)直腸癌細(xì)胞株對(duì)愛必妥耐藥。而愛必妥作用于BRAF野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)26%～40%，提示BRAF野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株對(duì)愛必妥作用敏感(圖2)。

2.2 維羅非尼對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株增殖的影響

0、0.1、1.0、10.0、50.0 μmol/mL 維羅非尼分別作用于BRAF突變型和野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞48和72 h 后，應(yīng)用MTT 方法檢測(cè)維羅非尼對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示維羅非尼無論對(duì)BRAF突變型還是野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞均有增殖抑制作用，而BRAF突變細(xì)胞更加顯著(圖3、圖4)。各細(xì)胞株IC50結(jié)果見表1。提示無論BRAF突變還是野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株對(duì)維羅非尼均較敏感。

圖1 愛必妥對(duì)BRAF突變細(xì)胞株抑制率Fig.1 Inhibition rate of cetuximab on BRAF mutant cell lines

圖2 愛必妥對(duì)BRAF野生細(xì)胞株抑制率Fig.2 Inhibition rate of cetuximab on BRAF wild cell lines

圖3 維羅非尼對(duì)BRAF突變細(xì)胞株抑制率Fig.3 Inhibition rate of vemurafenib on BRAF mutant cell lines

表1 各個(gè)細(xì)胞株基因突變情況及維羅非尼作用細(xì)胞的IC50

圖4 維羅非尼對(duì)BRAF野生細(xì)胞株抑制率Fig.4 Inhibition rate of vemurafenib on BRAF wild cell lines

2.3 維羅非尼增強(qiáng)愛必妥對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的敏感性

維羅非尼(2 μmol/mL)聯(lián)合愛必妥(10 μg/mL)作用72 h 后，與愛必妥單藥組相比，細(xì)胞存活率RKO從(93.71±3.61)% 降至(38.51±2.31)%，HT-29 從(86.22±4.86)% 降至(28.11± 3.32)%，DIFI從(77.21±2.44)%降至(28.45±6.12)%，CACO-2 從(82.55±4.64)%降至(20.57±3.57)%。聯(lián)合治療組與單藥治療組相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05 (圖5、圖6)。在長(zhǎng)時(shí)間集落形成實(shí)驗(yàn)中，兩藥聯(lián)合也能明顯抑制細(xì)胞集落的形成(圖7)。維羅非尼(2 μmol/mL)聯(lián)合愛必妥(10 μg/mL)作用24 h，p-EGFR、BRAF、p-ERK 均較單藥作用出現(xiàn)明顯下調(diào)(圖8)。結(jié)果表明，維羅非尼通過聯(lián)合作用抑制EGFR及其通路提高了BRAF突變及野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)愛必妥作用的敏感性。

圖5 兩藥聯(lián)合對(duì)BRAF突變細(xì)胞株抑制率Fig.5 Inhibition rate of combination on BRAF mutant cell lines*P<0.05,下圖同

圖6 兩藥聯(lián)合對(duì)BRAF野生細(xì)胞株抑制率Fig.6 Inhibition rate of combination on BRAF wild cell lines

圖7 4個(gè)細(xì)胞系集落形成實(shí)驗(yàn)Fig.7 Colony-forming assay of 4 cell lines

圖8 兩藥聯(lián)合明顯下調(diào)EGFR及其下游通路Fig.8 Two drugs significantly lowered EGFR and downstream pathway

3 討 論

隨著生活水平不斷提高，結(jié)直腸癌患者數(shù)量在世界范圍內(nèi)不斷攀升，目前結(jié)直腸癌仍是威脅人類生命的健康殺手。愛必妥作為首個(gè)獲批用于進(jìn)展期結(jié)直腸癌治療的抗EGFR單克隆抗體，通過競(jìng)爭(zhēng)性并特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的EGFR受體，有效阻斷下游通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。另外由于愛必妥是IgG1的單克隆抗體，其具有Fc段功能,因此能結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞活性的FcγRIII，通過免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞，即通過ADCC效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。ADCC效應(yīng)中愛必妥作為連接效應(yīng)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的橋梁發(fā)揮作用。

盡管愛必妥與化療結(jié)合可將mCRC中位生存期延長(zhǎng)至約24個(gè)月，但是單藥有效率不高于10%，如何進(jìn)一步提高療效，克服原發(fā)和繼發(fā)耐藥成為臨床研究的重要課題。研究表明，聯(lián)合使用不同靶點(diǎn)的靶向治療藥物可能是逆轉(zhuǎn)愛必妥耐藥的有效策略之一。

BRAF是EGFR/RAS下游通路上重要基因，是一種重要的致癌基因。BRAF突變?cè)贑RC中的發(fā)生率約為8%～16%[11-12]。目前通過基因檢測(cè)已明確BRAF突變的結(jié)直腸癌患者較野生型患者更容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移且無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)縮短。越來越多的證據(jù)支持，BRAF突變的晚期結(jié)直腸癌患者比野生型患者對(duì)愛必妥治療的有效率低或根本無反應(yīng)。然而BRAF突變是否可以作為EGFR單抗的療效預(yù)測(cè)因子，目前國際癌癥組織尚無統(tǒng)一定論[13-14]。本研究將濃度為0.1～100.0 μg/mL的愛必妥分別作用于BRAF突變型和野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株中48和72 h，結(jié)果顯示愛必妥對(duì)BRAF突變細(xì)胞株的增殖抑制作用并不顯著，因此判斷BRAF突變結(jié)直腸癌細(xì)胞株對(duì)抗EGFR治療耐藥。而BRAF野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株對(duì)EGFR單抗治療有反應(yīng)，判定為相對(duì)敏感。

維羅非尼是一種新型口服有效TKI類 BRAF 激酶抑制劑，其作用機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性及可逆性地與 BRAFV600E激酶結(jié)合，抑制激酶活化，阻斷MAPK通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。大量的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，維羅非尼對(duì)不可切除和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤治療有效[16]。然而，在轉(zhuǎn)移性BRAFV600E突變的結(jié)直腸癌中此類TKI藥物的有效率還不足10%。研究證實(shí)，EGFR 和MAPK通路的反饋激活是BRAFV600E突變的結(jié)直腸癌患者對(duì)維羅非尼耐藥的主要原因，在 BRAFV600E突變的結(jié)直腸癌患者中，聯(lián)合使用EGFR 抑制劑與維羅非尼可提高抗腫瘤的療效[17]。并且Martinelli等[18]發(fā)現(xiàn)多靶點(diǎn)的小分子TKI類靶向藥物索拉非尼(多吉美)無論在BRAF突變或野生型細(xì)胞株中都能有效提高愛必妥療效，這為本研究提供了理論依據(jù)。本研究將0.1～50.0 μg/mL 的維羅非尼分別作用于BRAF突變型和野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株48和72 h，結(jié)果顯示維羅非尼對(duì)兩種突變狀態(tài)不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞株均有增殖抑制作用，IC50均不高于7 μmol/mL，其在BRAF突變細(xì)胞株中更低。進(jìn)一步選用單藥維羅非尼(2 μmol/mL)、愛必妥(10 μg/mL)及兩藥聯(lián)合作用72 h 后，與愛必妥單藥作用組相比，細(xì)胞增殖抑制效果均得到加強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。在長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)集落形成實(shí)驗(yàn)中，兩藥聯(lián)合對(duì)不同突變狀態(tài)的結(jié)直腸癌細(xì)胞集落的形成也有明顯的抑制作用。結(jié)果表明，無論在BRAF突變還是野生型細(xì)胞中，維羅非尼均能有效提高愛必妥作用的敏感性。

MAPKs 通路由一組級(jí)聯(lián)激活的激酶組成，其激活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ERK1/2 是 MAPK 通路重要的家族蛋白的成員之一，活化的ERK與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、分化、細(xì)胞死亡、遷移等行為中發(fā)揮重要作用[19]。現(xiàn)已明確，細(xì)胞外信號(hào)通過激活EGFR并級(jí)聯(lián)激活下游通路中的關(guān)鍵激酶來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、分化，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。作為這條通路中的關(guān)鍵因子，BRAF基因的激活突變使下游通路持續(xù)活化而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷分裂、增殖，最終發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，以該通路中各個(gè)關(guān)鍵因子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物正在臨床前及臨床實(shí)驗(yàn)中廣泛研究[20]。本研究結(jié)果顯示，維羅非尼聯(lián)合愛必妥能夠加強(qiáng)其抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株增殖的效果，并且抑制EGFR、ERK的磷酸化，因此兩藥聯(lián)合通過抑制 RAS/RAF/MEK/ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的各個(gè)環(huán)節(jié)，下調(diào) p-ERK1/2 的表達(dá)，起到聯(lián)合抗腫瘤作用。綜上所述，本研究證實(shí)了無論在BRAFV600E突變還是BRAF野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞中，維羅非尼均可增強(qiáng)愛必妥抗腫瘤活性，增效作用是通過聯(lián)合作用，加強(qiáng)對(duì)EGFR及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制而實(shí)現(xiàn)的。后續(xù)研究將在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論。本研究結(jié)果為結(jié)直腸癌的聯(lián)合靶向治療提供新的方法和思路。

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Effects of Cetuximab Combined with Vemurafenib on Colorectal Cancer Cell Lines

MA Rui, XU Ling, QU Xiu-juan, CHE Xiao-fang, GUO Tian-shu, LIU Yun-peng

(1stAffil.Hosp.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110001)

The effects of cetuximabin combined with vemurafenib on wild type and mutant BRAF colorectal cancer cell lines were investigated. The cell proliferation was measured using MTT assay. The inhibitory effects of single and combination on cell proliferation were detected. Colony formation experiment: The inhibitory effect of different treatment factors on cell proliferation was confirmed by long-term culture of cells. The expression of EGFR and phosphor-EGFR and downstream pathway protein were determined by Western blotting. The results showed that for single drug therapy, BRAF wild group is relatively sensitive to cetuximab treatment. The inhibition of 100 μg/mL is 26%-40% in 72 h, whereas the BRAF mutation group of two cell lines was resistant to cetuximab. Both BRAF wild or mutant group cell lines were sensitive to vemurafenib, IC50 was less than 7 μmol/mL. The cell proliferative inhibition test showed the effect of two drug combinations were significantly lower than single drug cetuximab (P<0.05). Long time colony forming experiments confirmed that the combination in the area and the number of colony formation was significantly reduced. Western Blot experiment indicated that compared with single drug, two drug combination was significantly reduced p-EGFR, BRAF, p-ERK expression. The results showed that BRAF inhibitor vemurafenib can increase the sensitivity of cetuximab in either BRAF wild-type or mutant colorectal cancer cell lines.

cetuximab; vemurafenib; EGFR; BRAF; colorectal cancer

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81673025)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014021069)

馬瑞 女，助教，碩士。研究方向?yàn)槟[瘤學(xué)。Tel:024-83282312，E-mail:mary-414@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)槟[瘤學(xué)。Tel: 024-83282312，E-mail:cmuliuyunpeng@hotmail.com

2017-01-29；

2017-04-05

Q939.9；R73

A

1005-7021(2017)02-0083-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.014