TLR9激動劑對約氏瘧原蟲體液免疫記憶的影響

季 遷， 劉英杰

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院 附屬衛(wèi)生學(xué)校，遼寧 沈陽 110034；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

TLR9激動劑對約氏瘧原蟲體液免疫記憶的影響

季 遷1， 劉英杰2*

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院 附屬衛(wèi)生學(xué)校，遼寧 沈陽 110034；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

為探討TLR9激動劑對瘧疾體液免疫記憶的影響，用非致死型約氏瘧原蟲感染BALB/c小鼠，感染前2 d注射TLR9激動劑CpGl826，90 d后進(jìn)行二次感染。薄血膜染色法觀察紅細(xì)胞感染率，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞懸液中記憶性和活化性B細(xì)胞百分比，雙夾心ELISA法檢測特異性抗體水平。結(jié)果顯示，二次感染前，TLR9激動劑處理鼠記憶性和活化性B細(xì)胞以及抗體水平略高于對照組；二次感染后，其再感染發(fā)生率和蟲血癥水平均略低于對照組；活化性B細(xì)胞和抗體以及記憶性B細(xì)胞也分別于二次感染后1 d和3 d出現(xiàn)了有意義的升高，且升高幅度均略高于對照組。表明TLR9激動劑對約氏瘧原蟲感染后體液免疫記憶的建立和維持有一定促進(jìn)作用。

TLR9激動劑；約氏瘧原蟲；記憶性B細(xì)胞；體液免疫

瘧原蟲感染所致的瘧疾流行于100多個國家和地區(qū)，是一種高發(fā)的寄生蟲病，2015年全球新增病例200多萬，有數(shù)10萬人因罹患此病而死亡[1]。研發(fā)有效疫苗是防控瘧疾最為有效的措施之一，而探明影響瘧疾免疫記憶建立與維持的相關(guān)因素是研發(fā)有效疫苗的前提和基礎(chǔ)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell, DC)是唯一能夠活化初始 T 細(xì)胞的專職抗原遞呈細(xì)胞，也是連接固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁細(xì)胞。研究表明，Toll樣受體 (Toll like receptor，TLR)是DC識別瘧原蟲抗原的主要模式識別受體，其表達(dá)水平直接介導(dǎo)DC對效應(yīng)細(xì)胞活化狀態(tài)的調(diào)控，進(jìn)而影響免疫記憶的建立與維持[2-3]。然而有關(guān)TLR9激動劑是否能直接促進(jìn)瘧疾體液免疫記憶的建立與維持卻少有報道。觀察宿主抵御再感染的狀況可直接判定其免疫記憶的時效性。間日瘧原蟲在我國流行最為廣泛，其生物學(xué)特征與非致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XNL，P.y17XNL)具有一定相似性[4]。為此，本研究擬建立P.y17XNL 鼠瘧模型，并給予外源性TLR9激動劑，通過再感染狀況觀察并分析其與記憶性B細(xì)胞及活化性B細(xì)胞數(shù)量變化的關(guān)系，進(jìn)一步探討TLR9激動劑在瘧疾體液免疫記憶建立與維持過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和瘧原蟲感染 雌性BALB/c小鼠，1.5～2月齡(中科院實驗動物研究所)，腹部感染P.y17XNL寄生的紅細(xì)胞(1×106個)；感染前2 d，小鼠經(jīng)脛骨前肌肉分別注射CpGl826(Takara)和CpGl982(對照)，50 μg/只。90 d后，用同數(shù)量瘧原蟲對小鼠進(jìn)行第二次感染。

1.1.2 血清與脾細(xì)胞采集 正常對照鼠和二次感染前(0 d)小鼠以及二次感染后1、3、5 d小鼠經(jīng)心臟采血1 mL左右，同時取出小鼠脾臟(5 d除外)。室溫條件下，血液靜置30 min后離心，收集血清，-80 ℃保存待抗體檢測。脾臟在200目篩網(wǎng)上研磨后，用含5% FCS 的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成懸液，350 g離心10 min，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，以含10% FCS 的RPMI1640懸浮細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1×107/mL，待后續(xù)染色與檢測。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染狀態(tài)觀察 感染不同時間點小鼠經(jīng)尾尖取血，涂薄血膜，吉姆薩染色10 min，光鏡下計數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2.2 血清特異性IgG抗體檢測 用質(zhì)量濃度為10 μg/mL的P.y17XNL抗原包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜，5%FCS封閉，洗滌后加入1∶100稀釋的抗血清，37 ℃ 2 h。洗滌后加入1∶500稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37 ℃ 1 h，加OPD-H2O2底物顯色15 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處OD值。

1.2.3 記憶性和活化性B細(xì)胞數(shù)量檢測 待測脾細(xì)胞懸液0.1 mL中加入PerCP-conjugated anti-mouse B220 mAb(BD Pharmingen)，然后再加入FITC-conjugated anti-mouse IgG mAb(BD Pharmingen)用于檢測記憶性B細(xì)胞；而加入PerCP-conjugated anti-mouse B220 mAb，然后再加入PE-conjugated anti-mouse CD69 mAb(BD Pharmingen)用于檢測活化性B細(xì)胞。4 ℃避光染色30 min，以含1% FCS的PBS洗滌2次，用500 μL含2%多聚甲醛的PBS懸浮固定，流式細(xì)胞分析儀檢測，利用FlowJo7.6.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)經(jīng)t試驗，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLR9激動劑對蟲血癥水平的影響

初次感染后3 d可見瘧原蟲感染的紅細(xì)胞出現(xiàn)于薄血膜上，隨后感染率逐漸增加，于感染后13 d達(dá)到峰值，但TLR9激動劑處理組的感染率于感染15 d后下降較快，大部分小鼠于感染后19 d自愈(圖1A)；第二次感染后，TLR9激動劑處理組和對照組的10只鼠中分別有5只(50%)和7只(70%)出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，且前者的感染率水平也略低于后者(圖1B)。這表明，TLR9激動劑對控制初次感染后期蟲血癥水平以及降低再感染發(fā)生率和紅細(xì)胞感染率均具有一定作用。

2.2 TLR9激動劑對血清中特異性IgG水平的影響

抵御再感染的發(fā)生主要依賴特異性抗體。第二次感染前后不同時間點的特異性IgG水平見圖2。與未感染的正常小鼠相比，TLR9激動劑處理組及對照組的血清中在二次感染前就存在一定水平的特異性IgG，但前者的水平略高于對照組；二次感染后1 d這些抗體均明顯增加(P<0.01)；二次感染后3 d，TLR9激動劑處理組的水平明顯高于對照組(P<0.05)。由此提示，TLR9激動劑對于體液免疫記憶的維持以及再感染后體液免疫應(yīng)答強(qiáng)度的提高均具有一定作用。

2.3 TLR9激動劑對活化性B細(xì)胞數(shù)量的影響

圖3表明，二次感染前，TLR9激動劑處理組脾細(xì)胞中活化性B細(xì)胞百分比略高于對照組。感染后1 d，TLR9激動劑處理組的水平和對照組均出現(xiàn)了有意義的升高(P<0.05)，但感染后3 d，前者比對照組升高更為顯著(P<0.05)。由此進(jìn)一步證明TLR9激動劑通過促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增加而提高體液免疫應(yīng)答強(qiáng)度，這與抗體的變化趨勢也完全吻合。

圖1 初次感染紅細(xì)胞感染率(A)和二次感染紅細(xì)胞感染率(B)

2.4 TLR9激動劑對記憶性B細(xì)胞數(shù)量的影響

圖4顯示，二次感染前，TLR9激動劑處理組脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞百分比略高于對照組，二次感染后3 d，兩者均出現(xiàn)了有意義的升高(P<0.01)，但在每一檢測時點，TLR9激動劑處理組記憶性B細(xì)胞的水平均略高于對照組(盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義)，這表明TLR9激動劑對記憶性B細(xì)胞的形成和數(shù)量維持均具有一定促進(jìn)作用。

圖2 P.y17XNL二次感染不同時間點特異性IgG水平Fig.2 The levels of specific IgG at different time points from mice after reinfection with P.y17XNL

圖3 P.y17XNL二次感染0、1和3 d活化性B細(xì)胞百分比Fig.3 The percentage of actived B cells on day of 0, 1 and 3 after reinfection with P.y17XNL

圖4 P.y17XNL二次感染0、1和3 d記憶性B細(xì)胞百分比Fig.4 The percentage of memory B cells on day of 0, 1 and 3 after reinfection with P.y17XNL

3 討 論

瘧疾反復(fù)感染在流行區(qū)極為常見，導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生的根本原因之一是人體不能建立持久的免疫記憶。影響免疫記憶的主要因素可能在于瘧原蟲對宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抑制效應(yīng)，其中包括對DC成熟和功能的抑制[5]。TLR是DC識別瘧原蟲抗原的主要模式識別受體。作為多受體家族的一員，TLR9主要識別瘧原蟲的DNA和瘧色素[6]。在TLR9介導(dǎo)下，DC完成對瘧原蟲抗原的內(nèi)化，隨之上調(diào)共刺激分子等多種表面分子表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)建立初始免疫應(yīng)答。雖然有研究表明，特異性抗體在防止發(fā)生再感染的過程中發(fā)揮不可或缺作用，瘧原蟲感染可刺激宿主產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，并維持部分記憶性B細(xì)胞的存在[7]；TLR9激動劑可促進(jìn)惡性瘧感染者產(chǎn)生記憶性B細(xì)胞[3]；但也有資料顯示，約氏瘧原蟲感染可誘發(fā)記憶性B細(xì)胞的消除[8]；伯氏瘧原蟲通過干擾生發(fā)中心微環(huán)境而影響B(tài)細(xì)胞的免疫記憶反應(yīng)[9]。我們的研究結(jié)果顯示，外源性TLR9激動劑對控制初次感染后期蟲血癥水平具有一定作用，同時可維持一定水平的特異性抗體及一定數(shù)量記憶性B細(xì)胞持續(xù)存在。二次感染后，活化性B細(xì)胞數(shù)量迅速升高并分泌高水平特異性IgG，進(jìn)而降低了再次感染的發(fā)生率和蟲血癥水平?；罨訠細(xì)胞短時間內(nèi)明顯增加除與一些初始B細(xì)胞開始活化有關(guān)外，更主要的原因可能與TLR9激動劑促進(jìn)初始感染后形成的記憶性B細(xì)胞迅速活化有關(guān)。有文獻(xiàn)報道，少許記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞的存在，雖然不能徹底防止再感染的發(fā)生，但也能顯著降低再感染的發(fā)生率與紅細(xì)胞感染率[10-11]。這與我們的研究結(jié)果完全契合。

有實驗證實，惡性瘧原蟲對免疫記憶形成具有明顯抑制效應(yīng)[12]，而痊愈后的間日瘧原蟲感染者其免疫記憶可持續(xù)存在一定時間[13]。提示，瘧原蟲毒力強(qiáng)弱或許是影響免疫記憶建立與維持的因素之一。本研究以毒力較弱的非致死型約氏瘧原蟲鼠瘧模型明確了TLR9激動劑對體液免疫記憶的建立和維持有一定促進(jìn)作用，但毒力較強(qiáng)的致死型約氏瘧原蟲模型是否能得出相同結(jié)論尚需進(jìn)一步證實。

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Effect of TLR9 Agonist on Humoral Immune Memory duringPlasmodiumyoeliiInfection

JI Qian1, LIU Ying-jie2

(1.TheAffil.HealthSchl.ofShenyangMed.Coll.,Shenyang110034; 2.Teach. &Res.Div.ofPatho.Biol.,Coll.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

The effect of TLR9 agonist on humoral immune memory during the infection withPlasmodiumspp. was investigated, BALB/c mice were infected with non-lethalP.yoelii, two days before the infection they were injected with LR9 agonist CpGl826, and after day 90 secondary infection was carried out. The parasitemia on thin blood membrane was observed by counting erythrocyte infection rate, and flow cytometry was used to analyze the percentage of memory and active B cells in spleen cell suspension, and the levels of specific antibody were also measured by double sandwich ELISA. It was found in the results that before the secondary infection, the memory and active B cell as well as the level of antibody of TLR9 treated mice were slightly higher than the control group; And after the secondary infection, the occurrence rate of re-infection and the parasitemia level was slightly lower than the control group, and active B cells and antibody as well as the memory B cells appeared significant rise on day 1 and day 3 d after secondary infection respectively, moreover, the rising scope were all slightly higher than the control group. These results suggested that TLR9 agonist had a certain enhancing effect on the establishment and the maintenance of humoral immune memory duringP.y17XNL infection.

TLR9 agonist;Plasmodiumyoelii; memory B cell; humoral immune

遼寧省自然科學(xué)基金項目(201202281)

季遷 女，副教授，碩士。主要從事生理與感染免疫研究。E-mail:1712441978@qq.com

* 通訊作者。男，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事瘧疾感染與免疫研究。E-mail：lyjcmu@163.com

2017-01-25；

2017-03-09

Q939.91；R392

A

1005-7021(2017)02-0089-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.015