穩(wěn)心顆粒對大鼠心肌肥厚及Connexin43表達(dá)的影響

龍俊蓉++鄧彪++劉盛權(quán)++唐芬++譚文婷++劉茂軍++楊軍++褚春

[摘要] 目的 觀察穩(wěn)心顆粒對壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚和QT離散度以及縫隙連接蛋白43（Cx43）表達(dá)的影響。 方法 取45只雄性SD大鼠，以完全隨機(jī)法分為正常組（N組）、心肌肥厚組（H組）、穩(wěn)心顆粒組（W組）。采用腹主動脈縮窄法構(gòu)建心肌肥厚大鼠模型，給予穩(wěn)心顆粒6.25 g/（kg·d）治療12周后，行超聲心動圖檢測，并測定大鼠QT離散度，處死大鼠后以HE染色觀察心肌病理形態(tài)變化，免疫組化法檢測左室心肌Cx43蛋白的表達(dá)及分布，逆轉(zhuǎn)錄-鏈?zhǔn)骄酆厦阜z測心肌細(xì)胞Cx43 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 創(chuàng)建了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠模型，超聲心動圖檢測顯示，與N組比較，H組大鼠出現(xiàn)明顯心肌肥厚；W組和H組比較，以上參數(shù)有所改善。此外，H組的QT離散度比N組明顯增加，而經(jīng)穩(wěn)心顆粒干預(yù)后的W組QT離散度較H組降低。同時，與N組大鼠比較，H組可見心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，且左室心肌組織Cx43的蛋白和mRNA表達(dá)明顯減少；而W組和H組比較，心肌細(xì)胞排列紊亂則有所改善，Cx43的蛋白和mRNA的表達(dá)亦明顯上調(diào)。 結(jié)論 穩(wěn)心顆?？筛纳茐毫Τ?fù)荷大鼠的心肌肥厚，并降低QT離散度和改善心肌Cx43的重構(gòu)。

[關(guān)鍵詞] 穩(wěn)心顆粒；心肌肥厚；Cx43；QT離散度

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Wenxin Granules on cardiac hypertrophy and QT dispersion and the expression of connexin43 （Cx43） in pressure-overloaded rats. Methods Forty-five male Sprague-Dawley rats were divided into normal group （group N）， hypertrophy group （group H） and Wenxin Granules group （group W） by completely randomized method. The rat model of cardiac hypertrophy was established by constriction of abdominal aorta. When treated with Wenxin Granules 6.25 g/（kg·d） for 12 weeks， these rats were detected by echocardiography and QT dispersion. The pathological morphology of ventricle tissue was observed by HE staining， the expression of Cx43 protein and Cx43 mRNA in left ventricle was respectively detected by immunohistochemistry and RT-PCR after rats were sacrificed. Results The rat model of cardiac hypertrophy induced by pressure overload was established. Compared with group N， the rats in group H had obvious hypertrophy. Compared with group H， the above parameters were improved in group W. In addition， the QT dispersion of group H was significantly higher than that of group N， and the QT dispersion of group W was lower than that of group H. Meanwhile， compared with group N， group H showed hypertrophy and disorder of cardiac muscle cell， and the expression of Cx43 protein and mRNA in left ventricle myocardium was significantly decreased； while the hypertrophy and disorder were improved in group W when compared with group H， Cx43 protein and mRNA expression was also significantly increased. Conclusion Wenxin Granules can improve cardiac hypertrophy in pressure-overloaded rats， decrease QT dispersion and improve the remodeling of Cx43 in myocardium.

[Key words] Wenxin Granules； Cardiac hypertrophy； Cx43； QT dispersion

心肌肥厚是心臟對于長期壓力負(fù)荷過大或者容量負(fù)荷過大所產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)[1]，從而發(fā)生細(xì)胞肥大、排列紊亂等一系列病理改變，其不僅可以引起多種離子通道重構(gòu)，也可導(dǎo)致縫隙連接重構(gòu)，從而誘發(fā)各種心律失常。心肌肥厚作為心衰進(jìn)展、心梗、猝死等心血管事件發(fā)生的一個獨(dú)立危險因素[2-3]，能夠顯著增加住院率和病死率，所涉及的機(jī)制就與其導(dǎo)致的心臟電生理重構(gòu)有關(guān)，而縫隙連接重構(gòu)又是電生理失穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[4]?？p隙連接與細(xì)胞間的化學(xué)交流和電沖動的傳導(dǎo)密切相關(guān)[5]，有研究發(fā)現(xiàn)，心肌中主要有三種縫隙連接蛋白，其中Cx43在心室肌中表達(dá)最多，少量分布于心房肌。當(dāng)發(fā)生心肌肥厚時，Cx43表達(dá)下調(diào)[6]，引起心肌細(xì)胞解偶聯(lián)，這與心律失常的發(fā)生及進(jìn)展息息相關(guān)。因此，以Cx43為靶點研發(fā)抗心律失常藥物成為當(dāng)今的一大熱點。穩(wěn)心顆粒對治療房顫、多形性室速等心律失常具有相當(dāng)理想的效果，可降低QT離散度（QTd）[7]，這可能與其選擇性阻滯心房鈉通道和抑制心室晚電位有關(guān)[8]，但其是否能對細(xì)胞間的連接蛋白重構(gòu)起作用，目前尚缺乏相關(guān)研究。本研究旨在探討穩(wěn)心顆粒對肥厚心肌和Cx43表達(dá)的影響，了解其對肥大心肌細(xì)胞及縫隙連接重構(gòu)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

45只6周齡SPF級雄性SD大鼠（180～200 g），動物合格證號：SYXK（湘）2015-0001，購自南華大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于恒溫（22±1℃）恒濕環(huán)境中，人工照明12 h，可自由獲得水和食物。步長穩(wěn)心顆粒（陜西步長制藥公司，批號1505093）；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、一抗Cx43（10D101）、羊抗兔二抗（150361）（武漢博士德公司）。

1.2 制備心肌肥厚模型

采用改良腹主動脈縮窄法[9]造模。以完全隨機(jī)法將大鼠分成三組：正常組（N組），心肌肥厚組（H組），穩(wěn)心顆粒組（W組）。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，劑量為每只3 mL/kg。取左側(cè)臥位固定大鼠，以右腎的體表投影為中心做一2～3 cm的縱行切口后尋找右腎動脈，在腹主動脈發(fā)出右腎動脈分支點上方約2 mm處分離腹主動脈，H組和W組大鼠用4號縫線將直徑0.8 mm的針頭與腹主動脈一起結(jié)扎，隨后抽出針頭，還納臟器，縫合切口。N組不結(jié)扎腹主動脈，余處理相同。W組給予溶解了穩(wěn)心顆粒6.25 g/（kg·d）的生理鹽水灌胃，N組和H組則予等量生理鹽水。12周后測左室后壁及室間隔厚度，明顯增加提示造模成功。

1.3 測量QTd

12周后，同法麻醉并固定大鼠，將刺激電極（張家口教學(xué)儀器廠）插入大鼠皮下，行常規(guī)12導(dǎo)心電圖，Powlab 16導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞埃得公司）輸入信號，QTd即為最大QT間期（QTmax）與最小QT間期（QTmin）之差。

1.4 檢測超聲心動圖

12周后，麻醉并固定大鼠，胸前區(qū)備皮。用超聲探頭（頻率為13 MHz）置于左胸前，圖像深度調(diào)整至2.0～2.5 cm，由心臟彩超醫(yī)生測量左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）及左室舒張期內(nèi)徑（LVIDd）。

1.5 測定左室重量

稱量大鼠體重（BW），麻醉開胸，取出心臟后用生理鹽水洗凈，保留左室和室間隔，濾紙吸干水分，稱量左室重量（LVW），計算左室重量指數(shù)（LVM/BW）。

1.6 HE染色觀察

取部分左室心肌于10%甲醛中固定，石蠟包埋、切片，按步驟行HE染色，最后樹膠封片，在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.7 檢測心肌Cx43蛋白

取2～3 mm縱切左心室組織，按說明書行免疫組化染色，光鏡下心肌中的深棕色顆粒即為Cx43。使用IPP 6.0軟件測量染色區(qū)域的總光密度值和染色面積，兩者比值為平均光密度值（OD值）。

1.8 檢測細(xì)胞Cx43 mRNA

稱取80 mg心肌，研磨成粉末后提取組織RNA，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）說明書將11.5 μL RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參考Genebank資料設(shè)計并合成Cx43及β-actin的引物，在PCR儀（德國Biometra公司）中分別擴(kuò)增兩者序列長度至588 bp和400 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，再變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s并循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。取適量PCR產(chǎn)物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察，AlphaImager軟件掃描各DNA條帶，測得灰度值后計算半定量灰度比值（IDV比值）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物存活、電生理及心臟超聲結(jié)果

N組死亡4只，H組死亡5只，W組死亡6只，共30只大鼠完成實驗。造模12周后，各組大鼠QTd結(jié)果顯示：與其他兩組比較，H組大鼠QTd顯著增加（P < 0.05），而N組與W組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。大鼠LVW/BW結(jié)果顯示：與N組比較，H組大鼠的LVM/BW增加明顯（P < 0.05），而N組與W組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。各組大鼠心臟超聲結(jié)果顯示：與N組比較，H組大鼠心臟LVPWd、IVSd明顯增加，LVIDd則明顯減??；與H組比較，W組大鼠LVPWd、IVSd有所降低，LVIDd明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 HE染色結(jié)果

鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示與N組比較，H組心肌細(xì)胞排列紊亂，而用穩(wěn)心顆粒干預(yù)的W組，心肌細(xì)胞排列則有所改善。見圖1（封三）。

2.3 心肌Cx43蛋白表達(dá)的檢測

免疫組化結(jié)果顯示：左室心肌組織Cx43免疫標(biāo)記陽性蛋白呈深棕色顆粒（箭頭所示）。與N組比較，H組大鼠心肌組織Cx43蛋白表達(dá)下調(diào)，且排列紊亂。與H組比較，W組大鼠心肌組織Cx43表達(dá)增加。見圖2（封三）。

2.4 心肌組織Cx43 mRNA表達(dá)的檢測

實驗大鼠心肌Cx43及β-actin的mRNA表達(dá)水平及電泳條帶位置見圖3。從圖中可以看出，H組大鼠心肌組織Cx43mRNA的IDV比值較N組減?。≒ < 0.05）；而W組Cx43 mRNA的IDV比值較H組增大，提示穩(wěn)心顆粒干預(yù)能上調(diào)壓力超負(fù)荷下大鼠肥厚心肌組織Cx43 mRNA表達(dá)。

3 討論

心肌肥厚是長期處于超負(fù)荷狀態(tài)的心肌細(xì)胞在神經(jīng)體液因素影響下發(fā)生肥大、間質(zhì)增生等病理變化[10]，是心臟病變時的一個代償機(jī)制，伴隨著心肌重構(gòu)進(jìn)展到失代償期，引起心肌收縮力減退，最終發(fā)生心力衰竭[11-12]。本研究為了探究穩(wěn)心顆粒對心肌肥厚及Cx43的作用，通過腹主動脈縮窄法構(gòu)建了心肌肥厚大鼠模型，超聲心動圖顯示H組大鼠心臟LVPWd、IVSd明顯增加，LVIDd則明顯減小，提示心肌出現(xiàn)明顯肥厚，且HE染色結(jié)果表明H組大鼠心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，進(jìn)一步證明造模成功。

Cx43蛋白作為縫隙連接蛋白的一種，主要存在于心室肌。已有文獻(xiàn)報道[13-14]，Cx43的分布和表達(dá)在心肌重構(gòu)中有重要地位，因其正常的表達(dá)和分布是維持心臟正常電生理活動及協(xié)調(diào)舒縮功能的基礎(chǔ)之一[15]，而心肌重構(gòu)又可引起電生理紊亂及心臟舒縮功能受限。QTd是反映心室肌細(xì)胞復(fù)極不均一性和心電活動不穩(wěn)定性的一項電學(xué)定量指標(biāo)，因此測定QTd可以了解各組大鼠心電生理有無異常。本研究結(jié)果顯示，心肌肥厚的大鼠QTd明顯增加，表明心電活動受到影響。大鼠舒縮功能雖未明顯受限，但心肌細(xì)胞已有肥大，延長干預(yù)時間或許就能出現(xiàn)。本研究免疫組化結(jié)果表明，H組大鼠心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)減少，分布異常，電泳結(jié)果顯示mRNA表達(dá)下降，提示心肌肥厚引起了Cx43的重構(gòu)。研究表明，負(fù)荷誘導(dǎo)下的心肌肥厚可引起心肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)下調(diào)[16-17]，這與本研究結(jié)果吻合。此外，有學(xué)者認(rèn)為，Cx43在心肌缺血/再灌注損傷及心肌保護(hù)方面將是一個新的治療靶點[18-19]，因此，研究出對改善Cx43重構(gòu)的藥物有很大的前景。

穩(wěn)心顆粒以中醫(yī)理念為基礎(chǔ)，經(jīng)反復(fù)篩選，最終由三七、黨參、甘松、黃精、琥珀五味中藥組成[7]，是療效可觀的抗心律失常中成藥。有研究表明，穩(wěn)心顆粒能在一定程度上降低不良神經(jīng)內(nèi)分泌因素對心血管的破壞性，本研究結(jié)果也提示了穩(wěn)心顆粒干預(yù)12周后的大鼠心肌肥厚得到改善。朱艷霞等[20]研究顯示，穩(wěn)心顆粒可抑制膜離子通道作用及動作電位延長，改善心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而改善心血管的電重構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)穩(wěn)心顆粒干預(yù)后，H組大鼠的QTd明顯降低，進(jìn)而改善了心肌復(fù)極時限延長。但其在對Cx43重構(gòu)方面有無干預(yù)作用，尚無相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)心顆粒能夠上調(diào)肥厚心肌細(xì)胞Cx43蛋白和mRNA的表達(dá)，改善Cx43的紊亂排列，提示穩(wěn)心顆?？赡茉谝欢ǔ潭壬细深A(yù)了縫隙連接蛋白的重構(gòu)。

綜上所述，穩(wěn)心顆?？梢愿纳茐毫Τ?fù)荷下的心肌肥厚，機(jī)制可能與其改善Cx43重構(gòu)有關(guān)，但具體的信號調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。與此同時，穩(wěn)心顆粒除能有效抗心律失常外，還有望成為改善心肌肥厚，抑制心肌重構(gòu)、延緩心力衰竭進(jìn)程的第一種中成藥。

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（收稿日期：2017-01-02 本文編輯：張瑜杰）