福州野生蕉隱花色素和光敏色素基因家族的克隆及其表達(dá)分析

劉轉(zhuǎn)霞 余運(yùn)康 陳裕坤 馮新 劉煒?gòu)O 張梓浩 程春振 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 采用RT-PCR結(jié)合RACE法從福州野生蕉試管苗中克隆隱花色素和光敏色素基因家族成員的cDNA序列，命名為MuCry1、MuCry2a、MuCry2b、MuPhyB、MuPhyC1。MuCrys和MuPhys的cDNA序列依次為2 330、2 859、2 752、3 272、3 912 bp，編碼698、666、669、1 089、1 003個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明：MuCrys和MuPhys均屬不穩(wěn)定、親水蛋白，具跨膜結(jié)構(gòu)域和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，都不具信號(hào)肽，均定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：Cry1和Cry2聚為兩大類，其中MuCry1與小果野蕉、海棗和油棕Cry1的親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物大豆Cry1的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；MuCry2a和MuCry2b與小果野蕉、水稻和小麥Cry2的親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物碧桃Cry2的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；MuPhyB與小果野蕉PhyB的親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物毛果楊PhyB的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；MuPhyC1與小果野蕉和馬來蘭花蕉PhyC的親緣關(guān)系最近，與雙子葉甜橙PhyC親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。qRT-PCR結(jié)果表明：MuCry的3個(gè)成員和MuPhyC1對不同光質(zhì)響應(yīng)存在差異，藍(lán)光都可促進(jìn)MuCry 3個(gè)成員 mRNA的轉(zhuǎn)錄，紅光促進(jìn)MuPhyC1 mRNA的轉(zhuǎn)錄，在黑暗、紅光、綠光和黃光下MuCry1的表達(dá)受到抑制；黃光和紅光對MuCry2a的轉(zhuǎn)錄水平影響不明顯，而黑暗、暖白光和綠光可抑制MuCry2a的表達(dá)水平；MuCry2b的轉(zhuǎn)錄水平受藍(lán)光和紅光的正調(diào)控，而受綠光的負(fù)調(diào)控；MuPhyC1在紅光處理下的表達(dá)量最高，藍(lán)光和暖白光下的表達(dá)量相近，白光、綠光、黃光和黑暗處理下的表達(dá)量差異不大，表明MuPhyC1積極響應(yīng)紅光刺激。

關(guān)鍵詞 野生蕉；隱花色素；光敏色素；光質(zhì)處理；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The RT-PCR combined with RACE method was used to obtain Cryptochrome and Phytochrome gene family in the wild banana of Fuzhou， named MuCry1， MuCry2a， MuCry2b， MuPhyB and MuPhyC1. respectively. The cDNA sequences of MuCrys and MuPhys were 2 330， 2 859， 2 725， 3 272， 3 912 bp， encoding 698， 666， 669， 1 089 and 1 003 amino acids. Bioinformatics analysis showed that All MuCrys and MuPhys belong to the instability and hydrophilous proteins， and had transmembrane structures， and had no signal peptide， subcellularlocation predictions of them locating were in the nucleus. Phylogenetic anglicizing of Cry and Phy in plants indicated that not only Cry1 and Cry2， but also PhyB and PhyC belonged to the different branches， but they all had farthest genetic relationship with dicotyledons； MuCry1 have a close genetic relationship with MaCry1（Musa acuminata）， EgCry1（Elaeis guineensis）， and PdCry1（Phoenix dactylifera）， MuCry2a and MuCry2b belongs to the same branch with a close genetic relationship with MuCry2， and TaCry2（Triticum aestivum）， and OsCry2（Oryza sativaJaponica）， MuPhyB have a close genetic relationship with MuPhyB（Musa acuminata）， MuPhyC1 have a close genetic relationship with MuPhyC（Musa acuminata）and OmPhyC（Orchidantha maxillarioides）. qRT-PCR results revealed that three members of Cryptochrome gene family and MuPhyC1 had different responses to different light quality， and blue light could promote the transcription of MuCrys mRNA， and red light could promote the transcription of MuPhyC1. The expression of MuCry1 was inhibited in dark， red， green and yellow light； The effect of light on the transcription level of MuCry2a was not obvious， while dark， warm white and green light could suppress the expression level of MuCry2a. The transcriptional level of MuCry2b was positively regulated by blue and red light， and was negatively controled by green light； MuPhyC1 had the highest expression in red light， The expression level of white red， green， yellow and dark light treatment was not significant， indicating that MuPhyC1 positively responded to red light stimulation.

Key words Wild banana（Musa spp）； Crypthchrome； Phytochrome； light quality treatment； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.016

隱花色素（Cryptochrome，Cry）是重要的光受體之一，是一類通過吸收藍(lán)光和近紫外光[1]，進(jìn)而影響植物生長發(fā)育形態(tài)、新陳代謝和其自身對向光性反應(yīng)的光敏受體[1-2]，大多數(shù)植物的隱花色素都是黃素類蛋白，主要包括氨基酸PHR（photolyase-related）和羧基端CCT（Cryptochrome C Terminal）兩個(gè)明顯的功能區(qū)[1-3]。研究表明隱花色素與DNA光裂解酶結(jié)構(gòu)高度相似但功能各異，隱花色素?zé)o光裂解酶活性[1，4-5]，其廣泛存在于細(xì)菌、植物、動(dòng)物和人體內(nèi)[6-7]。最近新發(fā)現(xiàn)的隱花色素家族成員Cry-DASH[8]，僅在葉綠體和線粒體中檢測到，其缺少Cry蛋白典型的C末端延伸，但可能具有單鏈DNA光裂解酶活性[8-9]。植物隱花家族包括光裂解酶，Cry-DASH和植物隱花色素三類成員[1，7，9]。隱花色素作為藍(lán)光受體，其基因家族成員中Cry1和Cry2的C端包括一個(gè)可變區(qū)域，N端的相似性很高，包含碟呤和FAD兩種分子，Cry-DASH具有修復(fù)單鏈DNA的功能[8-9]，隱花色素出現(xiàn)于真核和原核分化之前，其DNA結(jié)合和依賴氧化還原的功能與光解酶一致，是一種轉(zhuǎn)錄抑制劑[1，7，9，10]。光敏色素（Phytochrome，Phy）是由4個(gè)生色團(tuán)與脫輔機(jī)蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成的一種易溶于水的調(diào)節(jié)生長發(fā)育的色素蛋白復(fù)合體，廣泛存在于植物界，在光合細(xì)菌中的含量較光合植物中高[10]，光合植物中Phy的表達(dá)幾乎不受環(huán)境光照的影響。研究發(fā)現(xiàn)植物中光敏色素家族基因包括PhyA、PhyB、PhyC、PhyD和PhyE五個(gè)成員[4，11]。近年來植物中關(guān)于隱花色素的研究主要包括幼苗的去黃化[12-15]、植物開花調(diào)節(jié)[16-17]、植物生物鐘[18]和氣孔開放的調(diào)控[19]、引發(fā)晝夜節(jié)律性[20]和調(diào)控基因的表達(dá)模式[21]、并表現(xiàn)出趨光性彎曲[22]的特性等方面，其中Cry1蛋白主要介導(dǎo)生物鐘調(diào)節(jié)以及抑制幼苗下胚軸伸長[14]，Cry2調(diào)控去黃化[12，14]等。近來還發(fā)現(xiàn)隱花色素參與植物對磁場的感應(yīng)[23]和細(xì)胞的程序性死亡[24]，同時(shí)林辰濤等[25]證明了植物隱花色素的光誘導(dǎo)蛋白質(zhì)二聚化反應(yīng)為其原初光反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，光敏色素對植物的生長發(fā)育的作用主要表現(xiàn)在調(diào)控植物花期[16-17]、介導(dǎo)植物光受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]、促進(jìn)種子萌發(fā)[13-14，27]和改變植物抗逆性[28]，通過調(diào)節(jié)植物自身的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控作物的產(chǎn)量[21，29]，其中PhyA介導(dǎo)遠(yuǎn)紅光信號(hào)下幼苗的光形態(tài)建成，是紅光下種子萌發(fā)和去黃化的主要光受體[26]，同時(shí)PhyB也參與抑制胚軸的伸長和促進(jìn)種子萌發(fā)[14]以及紅光信號(hào)下幼苗的光形態(tài)建成，其缺失則影響種子葉柄延長[14]、發(fā)育以及早花現(xiàn)象[16，27]，對于紅光感應(yīng)較弱的PhyC，與PhyB、PhyD、PhyE共同參與避蔭反應(yīng)和調(diào)節(jié)光下植物生長[13，19，28]，PhyD基因啟動(dòng)子在植物不同組織的活性存在明顯差異[12，14]。此外隱花色素和光敏色素的磷酸化可改變其活性，其蛋白互作共同參與并調(diào)控紅藍(lán)光作用[10，13-14，29]。

光是影響植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，隱花色素和光敏色素分別作為藍(lán)光和紅光受體，當(dāng)前研究已較為深入，但大多主要集中于擬南芥、水稻、小麥等模式植物幼苗去黃化、開花調(diào)節(jié)以及光形態(tài)建成等方面。目前關(guān)于隱花色素（MuCry）和光敏色素（MuPhy）在福州野生蕉（Musa spp.）[30]光形態(tài)建成方面的研究還未見報(bào)道，通過香蕉全基因組分析，香蕉基因組中隱花色素家族具有Cry1，Cry2a、Cry2b和Cry-DASH 4個(gè)成員，光敏色素有PhyA、PhyB、PhyC1和PhyC2 4個(gè)成員。香蕉作為世界4大水果之一，不僅在全世界種植廣泛，更是重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，但由于栽培過程中遭受光照不足、病害、低溫等脅迫使得產(chǎn)量下降和品質(zhì)嚴(yán)重不佳。本研究以福州野生蕉為材料，克隆得到隱花色素和光敏色素基因家族不同成員的基因序列，進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)以及蛋白的生物信息學(xué)分析，并借助qRT-PCR技術(shù)檢測各成員在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)情況，以期為探討隱花色素響應(yīng)藍(lán)光和光敏色素響應(yīng)紅光的機(jī)制提供理論依據(jù)，為隱花色素和光敏色素參與香蕉光質(zhì)應(yīng)答和光形態(tài)建成等方面的功能研究奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為解決生產(chǎn)中香蕉光照不足導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)問題提供解決辦法的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與光質(zhì)處理

以福州野生蕉（Musa spp.）組培苗為供試材料提取總RNA；并選取大小和長勢一致的組培苗進(jìn)行光質(zhì)（紅、綠、黃、藍(lán)、白、暖白、黑暗）處理24 h，5個(gè)重復(fù)。取不同光質(zhì)（功率18 W）處理后的香蕉葉片于液氮中速凍，并保存于-80 ℃用于后續(xù)基因表達(dá)分析，以上材料均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 采用Column Plant RNAOUT 2.0試劑盒（TIANDZ，China）進(jìn)行香蕉總RNA的提取。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，后用紫外分光光度計(jì)檢測OD260/280在1.9～2.1之間且完整性良好的核酸備用。采用Thermo Scientific Rever-tAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，EU）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為帶AP（GGCCACGCGTC-GACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT）接頭的cDNA，作為ORF和3′-UTR擴(kuò)增的模板。采用SMARTTM RACE cDNA Amplification kit（Takara，Japan）進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，用于5′-UTR的擴(kuò)增。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 保守區(qū)擴(kuò)增：根據(jù)GenBank中馬來西亞小果野蕉（Musa.acuminata，AA group）全基因組（http：//banana-genome-hub.southgreen.fr/）結(jié)合GenBank中已經(jīng)登錄的多種植物相應(yīng)基因序列多重比對結(jié)果，選擇同源性比較高的基因片段進(jìn)行福州野生蕉MuCrys和MuPhys基因保守區(qū)的引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增，選取與預(yù)期片段大小一致的條帶進(jìn)行回收，以pMD18-T為載體、DH5α為感受態(tài)對回收片段進(jìn)行TA克隆。菌液PCR后選取陽性克隆子測序，篩選與目的片段大小相符的結(jié)果，經(jīng)BLAST進(jìn)行同源比對確定保守區(qū)序列。

3′-RACE和5′-RACE：采用RACE法，在得到保守序列的基礎(chǔ)上分別設(shè)計(jì)2條3′-RACE和5′-RACE特異引物，以福州野生蕉試管苗cDNA為模板，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)進(jìn)行3′未端序列和5′未端序列的擴(kuò)增。

拼接驗(yàn)證：對克隆所得保守序列、3′未端序列和5′未端序列的測序結(jié)果進(jìn)行全長拼接，設(shè)計(jì)拼接驗(yàn)證引物，PCR反應(yīng)驗(yàn)證拼接結(jié)果。以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。所有引物的序列、擴(kuò)增的目的片段大小、退火溫度及擴(kuò)增用途見表1。

PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照張銳[31]的方法，根據(jù)擴(kuò)增片段的不同，對PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。獲得目的片段后切膠回收，TA克隆后挑取陽性克隆子的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將有目的條帶的菌液送至華大基因公司測序。

1.2.3 基因序列分析 采用DNAMAN6.0進(jìn)行核苷酸序列比對和拼接。采用NCBI對福州野生蕉隱花色素和光敏色素家族基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對；以ExPASy Protparam軟件預(yù)測編碼蛋白的理化性質(zhì)；應(yīng)用SignalP 3.0 Server進(jìn)行編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測；以PSORT亞細(xì)胞定位；TMpered軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；應(yīng)用NetPhos2.0軟件進(jìn)行編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)則以EMBnet COILS軟件進(jìn)行預(yù)測；以NCBI blastp預(yù)測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；經(jīng)PSIPRED在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測以SWISS-MODEL進(jìn)行；最后采用Mega5.05軟件的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ法）構(gòu)建核苷酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復(fù)1 000次）評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 福州野生蕉隱花色素和光敏色素家族基因在不同光質(zhì)處理下的qRT-PCR分析 以Chen[32]等篩選的在非生物脅迫下表達(dá)較穩(wěn)定的CAC基因作為本研究定量分析的內(nèi)參基因，引物序列為CAC-qF（AACTCCTATGTTGCTCGCTTATG）和CAC-qR（GGC

TACTACTTCGGTTCTTTCAC），采用SYBR ExScript試劑盒（Takara，Japan）和羅氏LightCycler480儀器（Thermo Fisher，USA），以經(jīng)不同光質(zhì)處理的福州野生蕉組培苗的cDNA為模板，根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)的原則在MuCrys和MuPhys各基因的特異位置設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照馮[33]等的方法。待反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線、溶解曲線（60～95 ℃）和凝膠電泳分析，檢測引物的特異性；每個(gè)反應(yīng)包括3個(gè)重復(fù)，在樣品擴(kuò)增的同時(shí)，將不同光質(zhì)處理的cDNA模板的混合樣進(jìn)行5倍梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從擴(kuò)增曲線圖中得到Ct值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得不同處理下福州野生蕉隱花色素Crys和光敏色素Phys各基因的mRNA相對含量，通過內(nèi)參基因的校正最終得到目的基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行福州野生蕉隱花色素Crys和光敏色素Phys各基因在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)情況分析。數(shù)據(jù)分析采用Ex-cel和geNORM（version3.5）[34]軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 福州野生蕉MuCrys和MuPhys基因家族成員cDNA全長序列克隆及分析

本研究通過同源克隆的方法分別得到了MuCrys和MuPhys基因家族的保守區(qū)，并采用RACE法擴(kuò)增得到MuCrys和MuPhys的3′末端序列和5′末端序列，通過DNAMAN6.0拼接驗(yàn)證，得到MuCry1的cDNA序列2 330 bp，MuCry2a的cDNA全長2 859 bp，MuCry2b的cDNA全長2 725 bp，MuPhyB的cDNA序列3 272 bp，MuPhyC1的cDNA全長3 912 bp（具體見表2）。MuCry1和MuCry2a的終止密碼子是TAG，MuCry2b和MuPhyC1的終止密碼子是TAA，MuPhyB的終止密碼子是TGA。將以上序列的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列分別在NCBI上進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示MuCrys和MuPhys與數(shù)據(jù)庫中已知的毛果楊（Populus tremula）、海棗（Phoneix dactylifera）、油棕（Elaeis guineensis）等的Crys、Phys基因序列高度同源。因此推斷已經(jīng)成功克隆得到福州野生蕉隱花色素Crys基因家族和光敏色素Phys基因家族的序列，分別命名為MuCry1（登錄號(hào)KX236155）、MuCry2a（登錄號(hào)KX236156）、MuCry2b（登錄號(hào)KX236157）、MuPhyB（登錄號(hào)KX247367）、MuPhyC1（登錄號(hào)KX247368）。

2.2 福州野生蕉MuCrys和MuPhys的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy Protparam預(yù)測MuCry1、MuCry2a、MuCry2b、MuPhyB和MuPhyC1的理化性質(zhì)，具體見表3。其信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及其磷酸化位點(diǎn)預(yù)測等見表2，其中磷酸化位點(diǎn)MuCry1（Ser：27，Thr：6，Tyr：7）、MuCry2a（Ser：30，Thr：3，Tyr：7）、MuCry2b（Ser：33，Thr：3，Tyr：6）、MuPhyB （Ser：40，Thr：6，Tyr：12）和MuPhyC1（Ser：32，Thr：8，Tyr：6）。以PSORT預(yù)測可知MuCry1定位于微體，MuCry2a定位于細(xì)胞核和微體，MuCry2b定位于微體和質(zhì)膜，MuPhyB定位于線粒體類囊體膜、線粒體基質(zhì)和質(zhì)膜，MuPhyC1定位于線粒體基質(zhì)和質(zhì)膜。經(jīng)NCBI blastp預(yù)測，MuCrys都含有crypt_chrom_pln保守結(jié)構(gòu)域（20～484 aa），其中MuCry1的N端含有與DNA光裂合酶相關(guān)（photolyase-related，PHR）的保守結(jié)構(gòu)域（19～181 aa），中間為FAD綁定功能域（221～498 aa），C端為Cryptochrome-C超家族（524～637 aa）；MuCry2a和MuCry2b的N端分別含有與DNA光裂合酶相關(guān)（photolyase-related，PHR）的保守結(jié)構(gòu)域（7～161 aa）和（7～162 aa），中間為FAD綁定功能域（212～489 aa），但C端無Cryptochrome-C超家族（圖1）。光敏色素包括有兩個(gè)中心區(qū)域，即N末端光感受區(qū)和C末端光調(diào)節(jié)區(qū)，其中MuPhyB的N末端光感受區(qū)包括一個(gè)PAS光感應(yīng)區(qū)域（122～240 aa），GAF（cGMP phosphodiesterase-adenylyl cyclas-FhlA，GAF）綁定功能域（273～411 aa）和光敏色素結(jié)構(gòu)域PHY（418～588 aa），C末端光調(diào)節(jié)區(qū)包括PAS光感應(yīng)區(qū)（518～632 aa），HATPase區(qū)域（868～981 aa），HisKA區(qū)域（761-819 aa），MuPhyC1的N末端光感受區(qū)包括一個(gè)PAS光感應(yīng)區(qū)域（57～141 aa），GAF綁定功能域（174～308 aa）和光敏色素結(jié)構(gòu)域PHY（315～487 aa），C末端光調(diào)節(jié)區(qū)包括PAS光感應(yīng)區(qū)（624～681 aa），PAS-8區(qū)域（725～833 aa），HATPase區(qū)域（967～1 079 aa），HisKA區(qū)域（855～910 aa），見圖2。經(jīng)PSIPRED在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，MuCry1、MuCry2a和MuCry2b主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成，MuCry1中α-螺旋31.8%、無規(guī)則卷曲61.9%、β-折疊6.3%；MuCry2a中α-螺旋34.8%、無規(guī)則卷曲59.5%、β-折疊5.7%；MuCry2b中α-螺旋35.7%、無規(guī)則卷曲57.8%、β-折疊6.5%；MuPhyB主要以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，所占比例為45.91%；無規(guī)則卷曲為40.22%；β折疊13.87%；而MuPhyC11蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占43.37%；α螺旋41.87%，β折疊14.76%。采用SWISS-MODEL軟件進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，可見MuCrys蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較相近，N端區(qū)域主要由多個(gè)α-螺旋和β-折疊共同構(gòu)成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而C端區(qū)域主要由無規(guī)則卷曲組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果相符（圖3），MuPhyB和MuPhyC1的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大。最后采用Mega5.05 軟件的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ法）構(gòu)建核苷酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復(fù)1 000次）評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4、圖5）。

2.3 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究通過同源克隆的方法分別得到了福州野生蕉隱花色素基因家族MuCry1基因的保守區(qū)和5′末端、MuCry2a和MuCry2b的cDNA全長，光敏色素基因家族MuPhyB的保守序列以及MuPhyC1的cDNA全長。并通過NCBI進(jìn)行blastn比對發(fā)現(xiàn)，MuCry1與油棕（Elaeis guineensis，XP_010939647.1）Cry1基因的同源性高達(dá)81%，MuCry2a與海棗（Phoenix dactylifera，XP_008790851.1）Cry2a的同源性達(dá)75%，MuCry2b與菠蘿（Ananas comosus，OAY67638.1）Cry2b基因的同源性高達(dá)74%，MuPhyB與海棗（Phoenix dactylifera，XP_008790851.1）PhyB的同源性高達(dá)77%，MuPhyC1與毛果楊（Populus tremula，XP_002318913.1）PhyC的同源性達(dá)75%。為了進(jìn)一步研究MuCrys和MuPhys各基因的保守性，經(jīng)NCBI blastp預(yù)測，MuCrys都含有保守結(jié)構(gòu)域crypt_chrom_pln，MuCrys的N端含有與DNA光裂合酶相關(guān)（photolyase-related，PHR）的保守結(jié)構(gòu)域，中間為FAD綁定功能域，且MuCry1C端具Cryptochrome-C超家族。NCBI blastn預(yù)測表明MuPhyB和MuPhyC1各含有一段可變剪接體，可能會(huì)造成MuPhyB和MuPhyC1在香蕉表達(dá)中的功能缺失。為了研究植物MuCry和MuPhy的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）、玉米（Zea mays）、小果野蕉（Musa acuminata）、菠蘿（Ananas comosus）、番茄（Solanum lycopersicum）和煙草（Nicotiana sylvestris）等的40多條Cry和Phy的氨基酸序列，利用Mega5.05軟件的鄰近相鄰法（NJ法）構(gòu)建植物Cry和Phy的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4、5），結(jié)果表明：植物Cry1和Cry2根據(jù)種屬聚為兩大類，其中MuCry1與小果野蕉、海棗和油棕Cry1的親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物大豆Cry1的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；MuCry2a和MuCry2b與小果野蕉、水稻和小麥Cry2的親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物碧桃Cry2的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；MuPhyB與小果野蕉PhyB的親緣關(guān)系最近，與雙子葉毛果楊PhyB的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；MuPhyC1與馬來蘭花蕉PhyC的親緣關(guān)系最近，與雙子葉甜橙PhyC親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 福州野生蕉隱花色素MuCrys和光敏色素MuPhyC1在不同光質(zhì)條件下的表達(dá)分析

采用qRT-PCR法研究福州野生蕉隱花色素MuCrys和光敏色素MuPhyC1基因家族共4個(gè)成員在不同光質(zhì)處理（黑暗、紅光、綠光、黃光、藍(lán)光、白光和暖白光）條件下的表達(dá)模式（圖6），結(jié)果表明不同光質(zhì)處理下，MuCry1對不同光質(zhì)響應(yīng)存在差異，其中藍(lán)光和暖白光下的表達(dá)量高于對照（白光），尤其是藍(lán)光下的相對表達(dá)量最高，說明藍(lán)光刺激可促進(jìn)MuCry1 mRNA的轉(zhuǎn)錄，而在黑暗，紅光，綠光和黃光下表達(dá)量低于對照，說明這些光質(zhì)處理抑制了MuCry1的表達(dá)。MuCry2a在藍(lán)光處理下的表達(dá)量高于對照，黃光和紅光處理與對照的相對表達(dá)水平相近，而黑暗、暖白光和綠光處理下表達(dá)量低于對照，說明藍(lán)光可提高M(jìn)uCry2a的表達(dá)水平。MuCry2b也差異性的響應(yīng)不同光質(zhì)的處理，在藍(lán)光下的表達(dá)量最高，依次分別為紅光，黃光，白光（CK），暖白，綠光和黑暗，說明MuCry2b的轉(zhuǎn)錄水平受藍(lán)光和紅光的正調(diào)控，而受綠光的負(fù)調(diào)控。MuPhyC1對于不同的光處理也顯示出差異性表達(dá)，在紅光下的表達(dá)量最高，說明MuPhyC1 mRNA的轉(zhuǎn)錄受紅光的影響，其在藍(lán)光和暖白光下的表達(dá)量相近，白光、綠光、黃光和黑暗處理下的表達(dá)量差異不大，說明MuPhyC1積極響應(yīng)紅光刺激。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果說明了福州野生蕉隱花色素MuCry基因家族3個(gè)成員的光響應(yīng)表達(dá)模式相似，它們都能正向響應(yīng)藍(lán)光的刺激，綠光和黑暗處理則對3個(gè)成員的表達(dá)均起抑制作用。而光敏色素家族基因MuPhyC1作為紅光的受體基因之一，其轉(zhuǎn)錄水平受紅光的正調(diào)控，受綠光的負(fù)調(diào)控。結(jié)果表明藍(lán)光和綠光能調(diào)控隱花色素基因的表達(dá)，紅光和綠光調(diào)控光敏色素的表達(dá)，兩者通過在光形態(tài)建成中起作用乃至相互作用，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育過程，參與光機(jī)制的建成。

3 討論

隱花色素和光敏色素家族基因在不同物種中的成員數(shù)量不同，如在擬南芥[8]中存在3個(gè)Cry成員，水稻、番茄和燕麥[3，6]中也存在至少3個(gè)Cry成員，在蘋果中也存在2個(gè)Cry成員，龍眼中存在3個(gè)Cry成員，蕨類和苔蘚[35]中亦存在至少5個(gè)Cry基因；光敏色素在蘋果、蘿卜[15]等雙子葉植物中有至少五個(gè)成員，而在香蕉、小麥、玉米[15]等單子葉植物中，目前只發(fā)現(xiàn)了三個(gè)成員。經(jīng)過香蕉全基因組分析檢索獲得MuCry1、MuCry2a、MuCry2b和MuCry-DASH等4個(gè)具有完整CDS的Cryptochrome家族基因，分別位于6號(hào)、5號(hào)（MuCry2a、MuCry2b）和1號(hào)染色體上；同時(shí)獲得MuPhyA、MuPhyB、MuPhyC1和MuPhyC2等4個(gè)具有完整CDS的Phytochrome家族基因，分別位于1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)和4號(hào)染色體上。生物信息學(xué)分析表明MuCrys和MuPhys均屬親水蛋白，具跨膜結(jié)構(gòu)，不具信號(hào)肽，均定位于細(xì)胞核，MuCrys都含有crypt_chrom_pln保守結(jié)構(gòu)域，但MuCry2a和MuCry2b無Cryptochrome-C超家族。MuCrys氨基酸末端區(qū)域PHR與光解酶的序列同源，但光解酶結(jié)合在DNA損傷部位和催化DNA修復(fù)的氨基酸殘基在隱花色素中不存在，因此除Cry-DASH外其余隱花色素雖為感光受體，但不具有光解酶的活性[2]。MuCrys和MuPhys的生物信息學(xué)分析結(jié)果與前人研究相符，故初步推斷MuCrys和MuPhys為福州野生蕉隱花色素和光敏色素，其可能參與并調(diào)控福州野生蕉光形態(tài)建成、幼苗去黃化以及蛋白互作等功能。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MuCrys和MuPhyC1在不同光質(zhì)下的表達(dá)調(diào)控模式，結(jié)果表明MuCrys和MuPhyC1對不同光質(zhì)響應(yīng)存在差異，藍(lán)光刺激可促進(jìn)MuCrys mRNA的轉(zhuǎn)錄，MuCrys都表現(xiàn)出積極響應(yīng)藍(lán)光的特性，同時(shí)MuPhyC1正向調(diào)控紅光刺激，其mRNA的轉(zhuǎn)錄受紅光控制，作為編碼藍(lán)光受體的蛋白，MuCry2b在紅光條件下的相對表達(dá)量也較高，說明MuCry2b和MuPhyB蛋白互作進(jìn)而調(diào)控光形態(tài)建成。擬南芥突變體研究表明，Cry1介導(dǎo)抑制擬南芥下胚軸伸長[2]；植物去黃化反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，Cry1與PhyA和PhyB互作可以抑制種子下胚軸伸長和類黃酮生物合成[10，13，29]，促使子葉開放和改變基因表達(dá)[20]，除隱花色素外，光敏色素對藍(lán)光條件下的去黃化也起調(diào)節(jié)作用，擬南芥和番茄的研究表明藍(lán)光下PhyA和PhyB共同調(diào)節(jié)去黃化[4，8，19]，香蕉生長過程中易出現(xiàn)幼苗黃化現(xiàn)象，通過調(diào)控隱花色素和光敏色素可控制其黃化。同時(shí)藍(lán)光的磷酸化作用會(huì)因磁場變化而影響隱花色素的活性[9，27]，Ahmad等[7]認(rèn)為Cry2需要在紅光下被Phy磷酸化才能完全激活，MuCrys和MuPhys均含有極其豐富的蛋白磷酸化位點(diǎn)，除此之外MuCrys含有其它潛在功能位點(diǎn)，如N-糖基化位點(diǎn)，蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)。因此隱花色素還可能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化或其他潛在功能位點(diǎn)等方式調(diào)控目標(biāo)蛋白發(fā)揮其功能[38]。不同光質(zhì)通過觸發(fā)光受體刺激其感知光信號(hào)，進(jìn)而影響植物的光合特性、生長發(fā)育以及抗逆和衰老等[26，39]。香蕉生長過程中光照不足導(dǎo)致光合速率減緩，香蕉抗逆性降低，容易遭受一系列脅迫影響其生長發(fā)育，同時(shí)光照不足導(dǎo)致香蕉果實(shí)著色差，風(fēng)味不佳，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，因而研究隱花色素和光敏色素在香蕉光質(zhì)應(yīng)答以及光形態(tài)建成方面等的作用和機(jī)理顯得至關(guān)重要，其研究可以為香蕉產(chǎn)業(yè)增產(chǎn)增收增質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

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