廣西柳樹(shù)桑寄生內(nèi)生真菌的分離鑒定與抗腫瘤活性菌株篩選

龔斌 巫鑫 韋婷 廖日權(quán) 蘇本偉 宋靜靜 江國(guó)煥 朱開(kāi)昕

摘要： 該研究從廣西欽州市采集健康的柳樹(shù)桑寄生的根、莖和葉中分離并純化內(nèi)生真菌，對(duì)真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，提取內(nèi)生真菌的DNA，采用真菌ITS序列對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分子鑒定。利用A549和H460細(xì)胞作為抗腫瘤活性指示細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定真菌乙酸乙酯提取物的抗腫瘤活性。經(jīng)過(guò)初步分離分析，從柳樹(shù)桑寄生中純化出27株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定它們分別屬于7個(gè)目9個(gè)屬15個(gè)種。擬盤(pán)多毛孢屬和間座殼屬為優(yōu)勢(shì)屬，其中擬盤(pán)多毛孢屬全部定植于寄生根；其次為新殼梭孢屬、擬莖點(diǎn)霉屬和球座菌屬，各分離到3株；其他包括青霉屬、鐮刀菌屬、炭疽菌屬和派倫霉屬，各分離到1株?？鼓[瘤活性研究表明，有一株與Pestalotiopsis protearum的ITS序列相似性達(dá)100%的擬盤(pán)多毛孢屬菌株Gen24表現(xiàn)有抑制腫瘤細(xì)胞A549和H460生長(zhǎng)的特性，在真菌乙酸乙酯浸提物濃度為800 μg·mL1時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率達(dá)到了56.92%，對(duì)H460細(xì)胞的抑制率達(dá)到了70.11%。該研究結(jié)果表明廣西柳樹(shù)桑寄生內(nèi)生真菌較豐富，在寄主中的分布表現(xiàn)了一定的組織特異性，而且還存在一些具有抗腫瘤活性的菌株及其活性物質(zhì)可供進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞： 柳樹(shù)， 桑寄生， 內(nèi)生真菌， 擬盤(pán)多毛孢菌， 抗腫瘤

中圖分類(lèi)號(hào)： Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05063408

Abstract： Taxilli herba， the branches with leaves of T. chinensis （DC.） Danser， is a traditionally used Chinese medicine. T. herba has been used to cure powerless bones and tendons， cancer， virus infection， rheumatic arthralgia and so on. However， the endophytic fungi of T. herba has never been studied previously. In this article， the diversity of endophytic fungi in T. herba from Salix babylonica and their antitumor activity were researched. Endophytic fungi were isolated and purified from healthy stems， leaves and roots of Taxilli herba from Salix babylonica in Qinzhou and Guangxi， China. They were identified by morphological characterization firstly， and then the DNA of endophytes was extracted and subjected to ITS sequence analysis. The antitumor activity of ethyl acetate extracts from eight endophytic fungi was tested by MTT method using cancer cell A549 and H460. After preliminary separation， 27 strains of endophytes were isolated from Taxilli herba， and they belong to seven orders， nine genera and fifteen species respectively. Two strains， jin2 and jin30， share sequence max identity of ≤97% with available ITS sequences in NCBI database， and they formed a independent clade in Phylogenetic tree of ITSrDNA sequences of existing fungi. Therefore， jin2 and jin30 maybe identified as novel species. Pestalotiopsis and Diaporthe were the preponderant genera [accounting for colonization frequencies （CF） 25.9% for each]， and all the strains of Pestalotiopsis were isolated from roots. The isolating frequency of Neofusicoccum， Phomopsis and Guignardia were fewer， with three strains for each respectively. Other rare isolated fungi were Penicillium， Fusarium， Colletotrichum and Peyronellaea， with one strain for each. Tissue specificity of endophytes was also observed. For example， Penicillium sp. and Fusarium sp. colonized roots exclusively， Diaporthe arecae， Colletotrichum sp. can only colonized stems， and Guignardia sp. and Peyronellaea sp. only colonized leaves. The antitumor activity showed that one strain， which most related to Pestalotiopsis protearum with ITS sequence similarity at 100%， inhibited the growth of A549 and H460. The ethyl acetate extracts from fungus Gen24 inhibited the growth of A549 and H460 cell at concentration of 800 μg·mL1， with the inhibiting rate to A549 reached 56.92%， and the inhibiting rate to H460 reached 70.11%. Our research showed the diversity of endophytes from Taxilli herba， and the antitumor endophytes and compounds can be further studied.

Key words： Salix babylonica， Taxilli Herba， endophytic fungi， Pestalotiopsis， antitumor

桑寄生藥材為桑寄生科鈍果寄生屬?gòu)V寄生（Taxillus chinensis）的干燥帶葉莖枝，為中國(guó)傳統(tǒng)藥材，有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎元的功能（中國(guó)藥典，2010）。桑寄生具有廣寄性特點(diǎn)，可寄生150多種植物（朱開(kāi)昕等，2010），其中柳樹(shù)是其常見(jiàn)寄主之一。最近對(duì)不同寄主的桑寄生研究發(fā)現(xiàn)，紅花桑寄生總黃酮提取物有抗白血病功效（肖義軍等，2008），從桑寄生中提取的槲皮素 、槲皮苷有抗病毒功效（Choi et al， 2009），而柳樹(shù)寄主的桑寄生能累積寄主的水楊苷成分（Lu et al， 2012），增強(qiáng)其祛風(fēng)濕功效等，這使桑寄生受到越來(lái)越多的關(guān)注。

植物內(nèi)生真菌是指在某一時(shí)期生活在健康植物體內(nèi)但對(duì)寄主植物組織并不引起明顯侵染的真菌。目前研究過(guò)的植物中均發(fā)現(xiàn)有植物內(nèi)生菌的存在，根據(jù)專(zhuān)家保守估計(jì)，自然界的內(nèi)生真菌物種至少有150萬(wàn)種（Hawksworth， 1991）。然而，已被人類(lèi)描述的內(nèi)生真菌不到 7 萬(wàn)種（Zhang et al， 2015； Rodriguez et al， 2009； Xie et al， 2016）。Stierle et al（1993）首次在Science雜志報(bào)道從短葉紅豆杉（Taxus breviflia）中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌，藥用植物內(nèi)生真菌的研究成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。內(nèi)生菌不僅具有潛在的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值，而且也可能對(duì)藥用植物藥效的產(chǎn)生具有重要作用，如Yuan et al（2016）發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌孔孢霉菌株（Gilmaniella sp. AL12）可以促進(jìn)蒼術(shù)中類(lèi)倍半萜化合物的積累，Zhou et al（2015）報(bào)道蒼術(shù)中內(nèi)生細(xì)菌可以激發(fā)活性氧基團(tuán)，從而增加類(lèi)倍半萜化合物的含量和多樣性（Zhou et al， 2015）。

桑寄生在不同的寄主具有不同的藥用價(jià)值，那么以不同植物為寄主的桑寄生其內(nèi)生真菌種群如何，這些內(nèi)生真菌是否也具有一定藥效，與桑寄生的藥效有何聯(lián)系？弄清楚這些問(wèn)題有利于我們探討桑寄生內(nèi)生真菌對(duì)其藥效產(chǎn)生的影響，具有較重要的理論研究意義。本研究以欽州市采集的柳樹(shù)桑寄生植物為材料，對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其抗腫瘤活性菌株進(jìn)行篩選，為進(jìn)一步探明桑寄生植物內(nèi)生真菌資源多樣性及藥用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

采集位于廣西欽州市市內(nèi)、欽州港區(qū)、欽北郊區(qū)人工種植的柳樹(shù)上生長(zhǎng)的桑寄生，采集地直線距離5 km以上，共采集10株柳樹(shù)桑寄生的根、莖、葉，經(jīng)過(guò)欽州市中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所有關(guān)專(zhuān)家的鑒定，為桑寄生科鈍果寄生屬?gòu)V寄生。

PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200 g，加適量水煮沸20～30 min，2層紗布過(guò)濾獲得濾液，加入葡萄糖20 g和瓊脂15 g，補(bǔ)加純化水到1 000 mL，分裝三角瓶120 ℃滅菌30 min。

1.2 柳樹(shù)寄生內(nèi)生真菌的分離純化

將柳樹(shù)寄生樣品的根、莖、葉用自來(lái)水沖洗掉泥土，然后在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒程序：依次浸泡在75%酒精0.5 min，3%～5%有效氯的次氯酸鈉溶液3 min，75%的酒精0.5 min，然后再用無(wú)菌水沖洗3遍，在超凈操作臺(tái)中晾干，備用。將晾干后的樣品，在超凈臺(tái)中將其剪成約0.5 cm × 0.5 cm 左右小塊。將剪成的小塊鋪于PDA平板上。28 ℃倒置培養(yǎng)2～3周。平板需每天檢查真菌的生長(zhǎng)情況。一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲從組織小塊長(zhǎng)出，挑出菌絲尖端，馬上將其轉(zhuǎn)接到另一新的平板上，經(jīng)幾次純化后接種于PDA斜面，并保存于本實(shí)驗(yàn)室4～8 ℃冰箱。

1.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

在各菌株生長(zhǎng)的最佳時(shí)期，初步觀察菌落的形態(tài)、顏色、大小、生長(zhǎng)情況、菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)特征，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定（魏景超等，1979）。

1.4 內(nèi)生真菌DNA的提取

將分離得到的內(nèi)生真菌接種斜面培養(yǎng)基，經(jīng)活化后分別接種至5 mL不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃搖床上以150 r·min1 的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)6～7 d，12 000 r·min1離心5 min，取200 mg 濕的培養(yǎng)菌絲，加入液氮研磨菌體至勻漿狀，采用真菌DNA提取試劑盒（美國(guó)，omega）提取真菌的總DNA，具體過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 內(nèi)生真菌ITS rRNA 序列分析

使用通用引物ITS1/ITS4（ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴(kuò)增真菌ITS序列（Takamatsu et al， 2001），PCR產(chǎn)物直接送南京金斯瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。采用Blastn程序?qū)y(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索。調(diào)出與該序列相似性較高的核酸序列，采用Mega 5.0軟件包進(jìn)行多重序列匹配排列和聚類(lèi)分析，形成一個(gè)多重序列匹配排列陣。采用鄰接法（Neighbor Joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 抗腫瘤活性檢測(cè)

將真菌接種到200 mL液體PDA培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r·min1 條件下進(jìn)行震蕩培養(yǎng)7～10 d，將得到的菌絲體和發(fā)酵液進(jìn)行干燥，干燥的菌絲體和發(fā)酵液稱(chēng)重后用乙酸乙酯進(jìn)行浸提以獲得浸提液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H460細(xì)胞，采用RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度到104 個(gè)·mL1，每孔100 μL加到96孔板中，置于37 ℃ 5%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加入不同濃度的真菌提取液的細(xì)胞培養(yǎng)基，提取物濃度依次為800、200、50 μg·mL1；陽(yáng)性對(duì)照組加入25、6.25、1.5和0.4 μmol·L1的阿霉素；陰性對(duì)照組為每孔加入與提取物同體積乙酸乙酯的細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)做三塊板。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用MTT法進(jìn)行細(xì)胞染色，在490 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值，并計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

2結(jié)果與分析

2.1 寄主為柳樹(shù)的桑寄生內(nèi)生真菌的分離

從寄主為柳樹(shù)的桑寄生根、莖、葉表面消毒組織塊（根組織塊247，葉組織274，莖組織221）分離純化到27株內(nèi)生真菌，這27株菌有的在PDA培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)孢，有的需要特殊條件誘導(dǎo)產(chǎn)孢。根據(jù)菌株的菌落（圖1）、菌絲體和孢子的形態(tài)特征，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定，這27株菌屬于9個(gè)屬，其中根部分離到5個(gè)屬共13株菌，占分離總量的48.15%；莖部分離到4個(gè)屬共8株菌，占分離總量的29.63%；葉中分離到4個(gè)屬共6株菌，占分離總量的22.22%（表1）。

2.2 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

采用 ITS 特異性引物對(duì)27株內(nèi)生真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)得到的序列進(jìn)行Blastn分析，結(jié)果表明所有的27株內(nèi)生真菌都屬于子囊菌門(mén)，分屬于7個(gè)目9個(gè)屬；27株菌種有26株與已有的真菌ITS序列相似性在96%以上，另外有一株jin2與GenBank中已有的序列相似對(duì)最高的只有93%，暫時(shí)定名為Diaporthe sp.（表 2）。

基于以柳樹(shù)為寄主的桑寄生分離的27株內(nèi)生真菌的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖 2），結(jié)果表明27株菌屬于8個(gè)分支（bootstrap值為100%），jin22、gen17、gen27、jin32、gen30、ye11、jin33、jin35、ye6都屬于間座殼目Diaporthales，與Diaporthe arecae、D. per

seae、D. pascoei、D.phaseolorum、Phomopsis liquidambari構(gòu)成一個(gè)支持率為100%的分支；gen2屬于肉座菌目Hypocreales，與Fusarium decemcellulare在一個(gè)分支（支持率為100%）；gen6、gen15、gen16、gen4、gen14、gen24、gen26都屬于炭角菌目Xylariales，與Pestalotiopsis neglecta、P. disseminata、P. heterocornis、P. microspora等菌株構(gòu)成一個(gè)支持率為100%的分支；Gen11屬于散囊菌目Eurotiales，與Penicillium oxalicum構(gòu)成一個(gè)分支（支持率為100%）；Ye2屬于格孢菌Pleosporales，與Peyronellaea glomerata聚類(lèi)在一個(gè)支持率為100%的分支；jin24、jin3、gen13、ye13、ye7、ye1對(duì)屬于葡萄座腔菌目Botryosphaeriales，其中jin24、jin3和gen13與Neofusicoccum parvum聚類(lèi)在一個(gè)分支（支持率為100%）；ye13、ye7和ye1與Guignardia mangiferae和Phyllosticta capitalensis的親緣關(guān)系比較近。在所有的菌株中，從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)看jin2和jin30形成了一個(gè)獨(dú)立的分支，分類(lèi)地位還不能確定，可能是新種，這有待進(jìn)一步研究。

2.3 內(nèi)生真菌在寄主為柳樹(shù)的桑寄生組織中的分布

在所有分離到的菌株中，擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis）和間座殼屬（Diaporthe）為優(yōu)勢(shì)屬，擬盤(pán)多毛孢屬分離到7株菌，分離率為25.9%，全部定植于以柳樹(shù)為寄主的桑寄生的寄生根；間座殼屬分離到7株，分離率為25.9%，廣泛分布于根、莖和葉組織。其次為新殼梭孢屬（Neofusicoccum）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）和球座菌屬（Guignardia），均分離到3株；其它包括青霉屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）和派倫霉屬（Peyronellaea），各分離到1株（表3）。

寄生根分離的內(nèi)生真菌還包括青霉屬、新殼梭孢屬、間座殼屬、鐮刀菌屬真菌，其中青霉屬和鐮刀菌屬為特異性寄生于根；莖部寄生的內(nèi)生真菌包括新殼梭孢屬、間座殼屬、鐮刀菌屬、炭疽菌屬和擬莖點(diǎn)霉屬， 其中間座殼屬的Diaporthe arecae和炭疽菌

屬為莖內(nèi)專(zhuān)性寄生；葉內(nèi)寄生的真菌包括間座殼屬、擬莖點(diǎn)霉屬、球座菌屬、派倫霉屬，其中球座菌屬和派倫霉屬為葉內(nèi)專(zhuān)性寄生（表3）。

2.4 抗腫瘤活性

挑選擬盤(pán)多毛孢屬5個(gè)種的代表菌株，以及新殼梭孢屬、擬莖點(diǎn)霉屬、派倫霉屬共8株菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，將菌絲體和發(fā)酵液在干燥箱中干燥后用乙酸乙酯進(jìn)行浸提。采用浸提物對(duì)A549和H460細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，以 A549和H460細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率表示抗腫瘤活性的大小。結(jié)果表明在檢測(cè)的8株真菌粗提物中，有一株擬盤(pán)多毛孢屬菌株Gen24表現(xiàn)有抑制A549和H460細(xì)胞生長(zhǎng)的特性，在浸提物濃度為800 μg·mL1時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率達(dá)到了56.92%，而對(duì)H460細(xì)胞的抑制率達(dá)到了70.11%，抗腫瘤活性明顯高于其他菌株，抑制A549細(xì)胞活性與陽(yáng)性對(duì)照阿霉素在6.25 μmol·L1時(shí)活性相當(dāng)

（圖 3），抑制H460細(xì)胞活性與陽(yáng)性對(duì)照阿霉素在25 μmol·L1時(shí)活性相當(dāng)（圖 4），而實(shí)驗(yàn)中添加有相應(yīng)乙酸乙酯提取溶劑的細(xì)胞培養(yǎng)液陰性對(duì)照對(duì)A549細(xì)胞無(wú)抑制（結(jié)果未顯示）。

3討論與結(jié)論

柳樹(shù)桑寄生是一種重要的中藥材，本研究首次報(bào)道了從廣西欽州市柳樹(shù)桑寄生中分離到27株共8個(gè)屬15個(gè)種的內(nèi)生真菌，并測(cè)定了內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性，為開(kāi)展內(nèi)生真菌在柳樹(shù)桑寄生藥用活性成分的生物合成機(jī)制等奠定了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)在柳樹(shù)桑寄生的寄生根中分離到5個(gè)屬10個(gè)種共13株內(nèi)生真菌，分離率為48.15%，其內(nèi)生真菌分離率、多樣性和分離到的絕對(duì)數(shù)量明顯高于莖和葉，而柳樹(shù)桑寄生的寄生根對(duì)于其從宿主獲取營(yíng)養(yǎng)成分非常重要，寄生根的內(nèi)生真菌多是否意味著內(nèi)生真菌可以幫助柳樹(shù)桑寄生從宿主獲取營(yíng)養(yǎng)，或者從宿主吸收次級(jí)代謝產(chǎn)物并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而形成柳樹(shù)寄生的活性成分還有待進(jìn)一步研究。

從根部分離的內(nèi)生真菌中，擬盤(pán)多毛孢屬有5個(gè)種共7株，從種類(lèi)和數(shù)量上都占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，并且是專(zhuān)性寄生于根部，這提示擬盤(pán)多毛孢可能對(duì)柳樹(shù)桑寄生吸收宿主的營(yíng)養(yǎng)或是次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化中可能具有重要意義。從本研究中，我們得到一株具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞A549 和H460的菌株Gen24，根據(jù)其ITS基因序列鑒定為擬盤(pán)多毛孢，與Pestalotiopsis protearum ITS序列相似性為100%。據(jù)報(bào)道，擬盤(pán)多毛孢是一種具有重要藥用價(jià)值的真菌，可以利用其提取到紫杉醇等多種藥物或前體物質(zhì)（Vennila et al， 2011； Gu et al， 2015； Xu et al， 2014），具有抗真菌（Li et al， 2008）、抗腫瘤（Liu et al， 2009）等活性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生紫杉醇等抗腫瘤活性物質(zhì)的擬盤(pán)多毛孢包括Pestalotiopsis microspora （Strobel et al， 1996）、Pestalotiopsis breviseta （Kathiravan et al， 2010）、Pestalotiopsis pauciseta （Vennila et al， 2011）、Pestalotiopsis malicola （Bi et al， 2013）、Pestalotiopsis hainanensis （Gu et al， 2015）等，而有關(guān)Pestalotiopsis protearum的研究還非常少，目前未發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道。

本研究從柳樹(shù)桑寄生中分離了內(nèi)生真菌，并對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并發(fā)現(xiàn)

了一株具有抗腫瘤活性的內(nèi)生真菌菌株，在后續(xù)研究中我們將研究?jī)?nèi)生真菌的活性物質(zhì)，并探討其在柳樹(shù)桑寄生次生代謝物轉(zhuǎn)化中的意義。

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