一種陽(yáng)春砂新栽培類型的鑒定

蔣燁 蘇景 湯麗云 徐杰 陳汝平 鄧汝榮 何國(guó)振

摘要： 該研究對(duì)3個(gè)陽(yáng)春砂栽培類型長(zhǎng)果、圓果、仲華，海南砂和1個(gè)疑似陽(yáng)春砂新栽培類型錦秋進(jìn)行了植物學(xué)性狀觀察、RAPD分子鑒定，并測(cè)定了各砂仁種質(zhì)的活性成分。結(jié)果表明：錦秋葉緣具有雙邊波狀和單邊波狀兩種現(xiàn)象，表現(xiàn)出處于長(zhǎng)果、圓果與海南砂之間；錦秋葉舌的長(zhǎng)度和開花物候期也介于海南砂和長(zhǎng)果、圓果之間；果實(shí)的性狀方面比較復(fù)雜，錦秋果實(shí)呈胖圓狀與圓果、海南砂相似，不同于長(zhǎng)果和仲華的長(zhǎng)圓形；果實(shí)黑褐色，不同于長(zhǎng)果、圓果的紅色而與仲華和海南砂相近；果刺尖銳狀與長(zhǎng)果、圓果和仲華的相似，不同于海南砂的平鈍形果刺。錦秋與仲華除果實(shí)形狀外的生物學(xué)性狀指標(biāo)都相似。從91個(gè)引物中隨機(jī)篩選出3個(gè)多態(tài)性豐富的引物，多態(tài)性比率為91.2%，顯示該物種遺傳變異較高；各個(gè)樣品間的相似系數(shù)在0.235 3～0.970 6之間，說(shuō)明五種砂仁種質(zhì)是有差別的；聚類分析顯示樣品可分為3類，海南砂聚為一大類；長(zhǎng)果、圓果、仲華和錦秋聚為另一大類，該大類中的長(zhǎng)果和圓果聚為一小類，仲華和錦秋聚為另一小類。聚類分析結(jié)果表明，錦秋是不同于已知三種栽培類型的陽(yáng)春砂新栽培類型。錦秋種子千粒重最大、揮發(fā)油含量最高，但其乙酸龍腦酯含量與其它砂仁種質(zhì)無(wú)差異。

關(guān)鍵詞： 錦秋， 陽(yáng)春砂， 種質(zhì)， 鑒定， 生物學(xué)性狀， RAPD

中圖分類號(hào)： Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05055411

Abstract： We found a candidate， named Jinqiu， of new Amomum villosum cultivar in October 2010. In order to find out the true identity of Jinqiu， four Amomum germplasms of A. villosum cv. Changguo， A. villosum cv. Yuanguo， A. villosum cv. Zhonghua and A. longiligulare， were planted together with Jinqiu in a field in the University Town of Guangzhou. A series of experiments were conducted to classify Jinqiu subsequently. Morphological traits investigation， RAPD analysis and bioactive compound quantification were carried out among five Amomum germplasms. The results showed that Jinqiu had two types of leaf margins， one was crisped in both sides of leaf blade and the other was half of entire and half of crisped. Changguo， Yuanguo and A. longiligulare had only one type of leaf margin. Changguo and Yuanguo were entire and A. longiligulare was half of entire and half of crisped. The ligule length of Jinqiu was longer than that of Changguo and Yuanguo but shorter than that of A. longiligulare. The date of first flowering of Jinqiu was later than that of Changguo and Yuanguo but earlier than that of A. longiligulare. The fruit shape of Jinqiu was bulbous which was similar to that of Yuanguo and A. longiligulare but different from that of Changguo and Zhonghua， which was long circle. The fruit colour of Jinqiu was dark brown which was different from that of Changguo and Yuanguo but similar to that of Zhonghua and A. longiligulare. The fruit colours of Changguo and Yuanguo were red. The fruit thorn of Junqiu was sharp which was similar to that of Changguo， Yuanguo and Zhonghua， but was different from that of A. longiligulare which was blunt. So Jinqiu and Zhonghua were similar in all biological traits except fruit shape. RAPDPCR results showed that three primers with abundant polymorphic amplified bands were randomly selected from 91 primers. That of 91.2% polymorphic ratio by one primer indicates there was high possibility of genetic variation in Amomum plants. Genetic similarity coefficients ranged from 0.235 3 to 0.970 6 that means there were differences among the five Amomum germplasms. According to the result of genetic relationship analysis， five germplasms were clustered into two categories： A. longiligulare was in one category and others were in another category. In the latter category， Changguo and Yuanguo were clustered into a small class； Jinqiu and Zhonghua were clustered into another small class. These results revealed that Jinqiu was a new kind of A. villosum cultivar. The weight of per thousand seeds of Jinqiu was the heaviest among that of five germplasms， and the content of volatile oil was also the highest， but the bornyl acetate content in Jinqiu had no significantly difference from others.

Key words： Jinqiu， Amomum villosum， germplasm， identification， biological traits， RAPD

砂仁為姜科植物陽(yáng)春砂（Amomum villosum）、海南砂（A. longiligulare）、綠殼砂（A. villosum Lour. var. xanthioides）的干燥成熟果實(shí)（國(guó)家藥典委員會(huì)， 2015）。砂仁性溫、味辛，具有芳香化濕、行氣寬中、降氣祛痰、溫脾止瀉和理氣安胎等功效（柯斌和師林， 2012），在我國(guó)有長(zhǎng)期的藥用和臨床使用歷史。陽(yáng)春砂果實(shí)春砂仁是傳統(tǒng)大宗藥材，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)估算，春砂仁產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)需求應(yīng)該在100億元以上，但因畝產(chǎn)量很低使春砂仁供不應(yīng)求（湯麗云等， 2012），而其低產(chǎn)的主要原因是陽(yáng)春砂自然授粉率低，落果率高。目前陽(yáng)春砂的栽培類型有長(zhǎng)果、圓果和仲華（何國(guó)振等， 2014），尋找或培育新種質(zhì)是解決陽(yáng)春砂單位產(chǎn)量低的根本方法。陽(yáng)春砂花期氣溫較低，活動(dòng)昆蟲的種類少，如果陽(yáng)春砂花期的氣溫高，活動(dòng)昆蟲種類會(huì)增多，因而選育遲花品種，有可能提高授粉率。2010年10月12日，作者在廣東省陽(yáng)春市砂仁試驗(yàn)示范場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了約3 m2的遲花植株，這些遲花植株的葉舌長(zhǎng)度介于陽(yáng)春砂仲華栽培類型和海南砂之間，開花的時(shí)間是9月中下旬，比已知的陽(yáng)春砂開花時(shí)間晚5個(gè)月，為了進(jìn)一步鑒定這一疑似新種質(zhì)，將部分植株移植到廣州大學(xué)城藥用植物分子與生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)春砂試驗(yàn)場(chǎng)，與陽(yáng)春砂長(zhǎng)果、圓果、仲華三個(gè)栽培類型及海南砂一起種植。

分子標(biāo)記技術(shù)為品種鑒定提供了形態(tài)鑒定外的證據(jù)，結(jié)合分子鑒定和形態(tài)鑒定的結(jié)果，可以使品種鑒定更加準(zhǔn)確。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA （Random Amplified Polymorphic DNA ， RAPD）是1990年由Williams和Welsh（Williams et al， 1990； Welsh & Mcclelland， 1990）發(fā)展起來(lái)的，是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是以隨機(jī)合成的寡聚核苷酸單鏈作為引物對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后檢測(cè)擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性， 這些多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性（唐克軒， 2005）。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)因其具有分析速度快、操作簡(jiǎn)單方便、樣品需要量少，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前運(yùn)用最廣泛的一類分子標(biāo)記技術(shù)（徐榮和陳君， 2006；戴小芬和朱建明，2003）。本研究通過(guò)形態(tài)鑒定、分子鑒定和化學(xué)成分測(cè)定，比較疑似新種質(zhì)與已有的陽(yáng)春砂各栽培類型和海南砂的差異，以判定是否屬于新的栽培類型。

1材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為陽(yáng)春砂三個(gè)栽培類型：長(zhǎng)果、圓果和仲華，海南砂，疑似新種質(zhì)（命名為“錦秋”）。陽(yáng)春砂和錦秋栽培在廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城陽(yáng)春砂試驗(yàn)場(chǎng)，海南砂栽培在距離試驗(yàn)場(chǎng)10 m左右的小山坡上。試驗(yàn)場(chǎng)用遮陰網(wǎng)遮陰，海南砂依靠樹木遮陰。各種質(zhì)的田間管理措施相同。

1.2 方法

1.2.1 五種砂仁種質(zhì)的形態(tài)性狀考察運(yùn)用傳統(tǒng)生物學(xué)觀察方法觀察砂仁各種質(zhì)的生物學(xué)性狀，調(diào)查的主要性狀及方法如下。

1.2.1.1 株高測(cè)量用軟尺測(cè)量從直立莖最下端膨大處至最上端葉片葉鞘與莖連接處的長(zhǎng)度。每種種質(zhì)測(cè)量20株植株。

1.2.1.2 葉的形態(tài)觀察及測(cè)量隨機(jī)選取各樣品植株，觀察每株植株所有葉片的形態(tài)，每個(gè)樣品觀察30株植株；取各樣品植株的第三片葉，觀察葉舌形態(tài)，并用軟尺測(cè)量葉舌長(zhǎng)度，測(cè)量時(shí)從葉舌與葉片連接的側(cè)面的最低點(diǎn)開始，到葉舌最高點(diǎn)為止，每樣品測(cè)量30個(gè)葉舌。

1.2.1.3 根狀莖形態(tài)觀察選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的五種砂仁種質(zhì)的植株，觀察其根狀莖（包括莖尖）的形態(tài)、顏色，每個(gè)樣品觀察30條根狀莖。

1.2.1.4 花芽及小花形態(tài)觀察在開花前，選取生長(zhǎng)一致的花芽，或于花期選取生長(zhǎng)一致的開放的小花，觀察花芽或小花形態(tài)，每個(gè)樣品觀察30個(gè)花芽或小花。

1.2.1.5 花期物候觀測(cè)于開花期間記錄五種砂仁種質(zhì)的始花期、盛花期和末花期。始花期是指某種砂仁種質(zhì)的花序當(dāng)天開放數(shù)為2花序/10 m2或以上；盛花期是指某種砂仁種質(zhì)的開花花序當(dāng)天開放數(shù)為20花序/10 m2或以上；末花期是指某種砂仁種質(zhì)的開花花序當(dāng)天開放數(shù)為10花序/10 m2或以下。

1.2.1.6 果實(shí)形態(tài)觀察于授粉后90 d，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的果實(shí)，觀察其形態(tài)、顏色，并測(cè)量其橫、縱莖大小，計(jì)算橫縱比，每個(gè)樣品觀察測(cè)量20個(gè)果實(shí)。

1.2.1.7 百果鮮、干重、千粒重測(cè)量于授粉后90 d，采摘生長(zhǎng)狀態(tài)一致的五種砂仁種質(zhì)的果實(shí)，測(cè)量其百果鮮重；在收獲果實(shí)后，將果實(shí)在50 ℃下烘干至恒重，測(cè)定果實(shí)的干重、種子千粒重。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 五種砂仁種質(zhì)的RAPD分析

1.2.2.1 基因組DNA的提取砂仁葉片基因組 DNA 的提取參照黃瓊林和楊錦芬（2010）的 CTAB 法。

1.2.2.2 RAPDPCR反應(yīng)體系的建立以五種砂仁種質(zhì)的DNA為模板，對(duì)S系列中的91個(gè)10聚體的寡核苷酸隨機(jī)引物（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的相關(guān)體系并參考相關(guān)文獻(xiàn)（王培訓(xùn)等，2000；徐吉銀和丁平，2005），確定PCR 反應(yīng)體系為總反應(yīng)體系共25 μL， 其中含有

ddH2O 17 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，MgCl2 （25 mmol·L1） 1.5μL， primer 1.0 μL （20 μmol·L1），10× dNTP 2.0 μL（10 mmol·L1 ），Taq酶0.125 μL（5 U·μL1）（Tiangen），DNA模板1.0 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，35 ℃（引物為S38），39 ℃（引物為S655和S207）退火45 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)40 次，72 ℃再次延伸10 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL加上2 μL上樣緩沖液和1 μL GoldView TM核染色液在1%的瓊脂糖凝膠以電壓 5 V·cm1電泳約 80 min。在凝膠成像分析儀（BIORAD）上觀察，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物選取條帶清晰、重復(fù)性好的進(jìn)行記錄。根據(jù)電泳圖譜中標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)反應(yīng)產(chǎn)物在凝膠上的位置，按凝膠圖譜上同一擴(kuò)增位點(diǎn)條帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”。用Ntsys2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出相應(yīng)的聚類圖和遺傳距離表，并進(jìn)行分析。

1.2.3 五種砂仁種質(zhì)的種子揮發(fā)油成分測(cè)定揮發(fā)油含量測(cè)定按照中國(guó)藥典2015版揮發(fā)油測(cè)定法甲法進(jìn)行；乙酸龍腦脂含量按照2015版中國(guó)藥典氣相色譜條件進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理利用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和OneWay ANOVA方差分析。數(shù)據(jù)表示為x-±s。

2結(jié)果與分析

2.1 五種砂仁種質(zhì)的生物學(xué)性狀比較

2.1.1 植株高度陽(yáng)春砂的莖分為根狀莖和直立莖。根狀莖匍匐于地面，直立莖散生，不分枝，基部膨大成球狀，是由葉鞘構(gòu)成的假莖（高江云等， 2006）。基部膨大成球狀的部分我們稱之為蘆頭。陽(yáng)春砂植株的高度是指直立莖的高度，我們定義為蘆頭至最上端葉片葉鞘與莖連接處的長(zhǎng)度。

五種砂仁種質(zhì)植株的高度如表1，錦秋植株最高，平均為258.58 cm，海南砂最矮，平均為179.22 cm。錦秋植株的高度明顯高于其他四種種質(zhì)植株，長(zhǎng)果與圓果的沒(méi)有顯著差異。砂仁植株的高度與所處環(huán)境的蔭蔽度關(guān)系密切，蔭蔽度大的植株相對(duì)較高，而蔭蔽度低的植株相對(duì)較矮。本文研究的五種砂仁種質(zhì)植株，其中四種，即長(zhǎng)果、圓果、仲華和錦秋生長(zhǎng)于蔭棚，它們的蔭蔽度相對(duì)一致，而海南砂生長(zhǎng)于樹林間，蔭蔽度與蔭棚的有所不同。因此，從表1

的數(shù)據(jù)不能肯定海南砂比其它四種種質(zhì)的植株矮，但可以比較的是，錦秋比長(zhǎng)果、圓果和仲華的植株高。

2.1.2 葉的形態(tài)取五種砂仁種質(zhì)的第三片葉片比較，觀察它們的差異。發(fā)現(xiàn)錦秋、仲華和海南砂葉片左或右邊有兩條明顯的與主脈平行的線，海南砂葉片的平行線尤其明顯，而長(zhǎng)果和圓果葉片的平行線不明顯或無(wú)（圖1）；海南砂的葉緣左或右邊全緣，另一側(cè)則呈波狀，而長(zhǎng)果和圓果的葉緣兩邊皆呈波狀，錦秋、仲華的葉片在直立莖上部的為單側(cè)波狀（圖1：C1、D1），與海南砂類似，而在下部的兩邊皆呈波狀（圖1：C2、D2），與長(zhǎng)果和圓果的類似。有趣的是，主脈的平行線處于全緣的一側(cè)，且葉片全緣的這邊靠近直立莖，波狀的一邊遠(yuǎn)離直立莖。

將五種砂仁種質(zhì)的第三葉的葉舌進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有明顯的差異。長(zhǎng)果、圓果、仲華和錦秋的葉舌都呈類梯形，而海南砂葉舌為長(zhǎng)條形，且質(zhì)地較?。▓D2）。長(zhǎng)果、圓果、仲華和錦秋的葉舌前端有凹陷，因而呈波狀，但這種現(xiàn)象是隨機(jī)的。長(zhǎng)果和圓果的葉舌最短，海南砂的葉舌最長(zhǎng)，仲華和錦秋的葉舌長(zhǎng)度介于中間（表1）。長(zhǎng)果和圓果葉舌的長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差異，仲華和錦秋之間的也沒(méi)有顯著差異。

2.1.3 根狀莖形態(tài)如圖3所示，五種砂仁種質(zhì)的根狀莖莖尖的形狀是相似的，均為錐狀，但顏色有差別。錦秋的根狀莖尖的顏色與長(zhǎng)果、圓果、仲華的一致，均為鮮紅色，而海南砂根狀莖尖為淺綠色或土黃色，有些甚至是白色。根狀莖尖顏色的不同與根狀莖的生長(zhǎng)習(xí)性有一定的關(guān)系，長(zhǎng)果、圓果、仲華、錦秋的根狀莖是在地面生長(zhǎng)的，可以接受光照；而海南砂根狀莖莖尖有朝地下生長(zhǎng)的趨勢(shì)，往往被落葉等覆蓋，不容易接受光照。

五種砂仁種質(zhì)的成熟根狀莖的顏色從外表看有差別。長(zhǎng)果與圓果根狀莖為綠色，包被的褐色鱗片極易脫落；海南砂、仲華根狀莖雖然也是綠色，但因?yàn)楹稚[片包裹且不易脫落，因而從表面來(lái)看顯示出褐色；錦秋根狀莖的顏色與仲華和海南砂的類似。

2.1.4 花芽和開放小花的形態(tài)花芽的形態(tài)與其生長(zhǎng)習(xí)性相關(guān)，錦秋及仲華的花芽開始時(shí)偏上性生長(zhǎng)，花芽前端可觸及地面，且沿地面生長(zhǎng)，最后伴隨花苞膨大前端挺起，因此錦秋及仲華的花芽貼地面生長(zhǎng)。

長(zhǎng)果、圓果及海南砂花芽開始時(shí)垂直于根狀莖橫出，生長(zhǎng)至一定程度后向上生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出斜出的形態(tài)。同一種質(zhì)的花芽長(zhǎng)度和顏色也有差別，這與地面覆蓋物的有無(wú)和厚薄有關(guān)，地面無(wú)覆蓋物的花芽顏色呈現(xiàn)紅褐色，有覆蓋物遮蓋的花芽顏色較淺；有覆蓋物遮蓋的花芽比無(wú)覆蓋物遮蓋的花芽長(zhǎng)（圖4）。

五種砂仁種質(zhì)的小花形態(tài)沒(méi)有明顯的差別，碗狀的唇瓣扣住假合蕊柱的頂端，假合蕊柱到唇瓣的縱向距離與橫向距離在各砂仁種質(zhì)間目測(cè)差別不明顯（圖5）。

2.1.5 花期表2觀察記錄了兩年的開花物候期，發(fā)現(xiàn)五種砂仁種質(zhì)的開花期有明顯的差別，長(zhǎng)果和圓果開花最早，仲華和錦秋次之，海南砂開花最遲。2015年長(zhǎng)果和圓果的開花時(shí)間是4月30日，仲華和錦秋遲了8～10 d，而海南砂遲了24 d。錦秋和仲華的花期有38～40 d，而長(zhǎng)果和圓果的花期只有26 d，海南砂的也只有30 d。錦秋和仲華的盛花期最長(zhǎng)，達(dá)到29 d，而長(zhǎng)果和圓果的不到15 d，海南砂的處于中間，為20 d左右。由于廣州市2016年1月出現(xiàn)了寒冷的極端天氣，其中24日氣溫低至0 ℃，罕見地下了鵝毛雪，使得2016年砂仁的開花時(shí)間明顯推遲，花期縮短，但五種砂仁種質(zhì)的花期物候的整個(gè)趨勢(shì)還是與2015年的相似。

2.1.6 果實(shí)形態(tài)測(cè)量了生長(zhǎng)90 d處于采摘期的果實(shí)大小（表3），結(jié)果顯示海南砂的果實(shí)最大，長(zhǎng)果和圓果的果實(shí)次之，仲華和錦秋的果實(shí)最小。錦秋果實(shí)的形狀與圓果、海南砂類似，呈胖圓形，其橫莖與縱徑比大于1；仲華的果實(shí)形狀顯長(zhǎng)圓形，其橫徑與縱徑比小于1。五種砂仁種質(zhì)的果實(shí)顏色可以分為兩類，長(zhǎng)果和圓果果實(shí)顏色為紅色或紅褐色，而仲華、錦秋和海南砂的果實(shí)顏色為黑褐色（圖6）。所以，錦秋的果實(shí)形狀與圓果、海南砂相近，而顏色則與仲華和海南砂相近。五種砂仁種質(zhì)的果實(shí)上的果刺形狀有差別，錦秋的果刺與仲華、長(zhǎng)果和圓果的果刺相似，與海南砂的比較顯得尖銳，而海南砂的果刺顯得平鈍。

2.1.7 百果重、種子千粒重表4顯示， 各砂仁種質(zhì)的百果重和種子千粒重有顯著差異。百果鮮重和干重都是海南砂最重，圓果次之，隨后為長(zhǎng)果，最后為錦秋，這與各砂仁種質(zhì)的果實(shí)大小是相匹配的；然而，各種質(zhì)果實(shí)的干鮮重比卻是錦秋最大，海南砂最小，說(shuō)明錦秋的干物質(zhì)積累最多。種子千粒重大小以錦秋的最大，長(zhǎng)果次之，隨后為圓果， 最后為海南

砂，這與果實(shí)的干鮮重比的順序基本吻合。

2.2 五種砂仁種質(zhì)的RAPD分析

2.2.1 RAPD引物篩選經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，從91個(gè)RAPD隨機(jī)引物中篩選出3個(gè)條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的引物（表5）。用篩選出的3條RAPD引物對(duì)五種砂仁種質(zhì)的DNA進(jìn)行RAPDPCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增位點(diǎn)共34條，其中多態(tài)性位點(diǎn)31條，平均多態(tài)百分率為91.2%，RAPD擴(kuò)增處理的DNA片段多態(tài)性豐富。RAPD反應(yīng)擴(kuò)增片段主要集中在0.25～3.0 kb之間（圖7）。

2.2.2 RAPD分子標(biāo)記的遺傳距離和聚類分析根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移率確定RAPD帶的分子量。RAPD擴(kuò)增譜帶用“1”表示有，用“0”表示無(wú)，得到一個(gè)二元矩陣。將0—1矩陣在Ntsys2.0軟件中進(jìn)

行處理，得到各品種間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離（表6），并獲得聚類圖（圖8）。

由表7可以看出，各砂仁種質(zhì)間的遺傳相似度在0.235 3～0.970 6之間。相似系數(shù)越大，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)最大的是長(zhǎng)果和圓果，其次是仲華和錦秋，說(shuō)明長(zhǎng)果與圓果、仲華與錦秋親緣關(guān)系十分相近，但是各個(gè)樣

品間的相似系數(shù)均小于1.0，說(shuō)明有一定遺傳距離，且能用特定的引物可將五種砂仁種質(zhì)區(qū)分，因此這五種砂仁種質(zhì)是各不相同的。

圖8聚類分析結(jié)果表明，五種砂仁種質(zhì)可聚為3類：其中海南砂與其它相似系數(shù)較小，歸為一大類，長(zhǎng)果、圓果、仲華、錦秋歸為另一大類；在長(zhǎng)果這一大類中，仲華和錦秋相似系數(shù)較大為一小類，而長(zhǎng)果和圓果歸為另一小類。因此， 錦秋可以歸類為陽(yáng)春砂而不是海南砂，與其遺傳關(guān)系最近的是仲華。

2.3 五種砂仁種質(zhì)的有效成分分析

2.3.1 揮發(fā)油含量錦秋揮發(fā)油含量與長(zhǎng)果、圓果或海南砂有顯著性差異，其揮發(fā)油含量最高（表7）。但除了海南砂達(dá)到了2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的種子團(tuán)揮發(fā)油含量不得少于1.0%的要求外，陽(yáng)春砂長(zhǎng)果和圓果均未達(dá)到揮發(fā)油含量不得少于3.0%的要求，如果錦秋屬于陽(yáng)春砂，則同樣未達(dá)到藥典要求。陽(yáng)春砂種子團(tuán)揮發(fā)油含量低的原因，一是可能實(shí)驗(yàn)條件不合適：由于測(cè)揮發(fā)油含量前要粉碎種子團(tuán)，可能粉碎儀器選擇不好，導(dǎo)致粉碎過(guò)程中損失過(guò)多的揮發(fā)油； 二是可能產(chǎn)地和栽培環(huán)境原因?qū)е缕洳环纤幍湟?，畢竟廣州不是陽(yáng)春砂的道地產(chǎn)區(qū)。但由于各砂仁種質(zhì)

的種子團(tuán)都是在相同條件下粉碎、提取和測(cè)定的，因此其揮發(fā)油含量的比較是有意義的。

2.3.2 乙酸龍腦酯含量 錦秋的乙酸龍腦酯含量與其它四種砂仁種質(zhì)的相似，相互間無(wú)顯著性差異（表7）。所有砂仁種質(zhì)的乙酸龍腦酯含量均未達(dá)到2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的不得少于0.90% 的要求。這也可能是實(shí)驗(yàn)條件或者產(chǎn)地不同等原因造成的。同樣，由于在相同的條件下粉碎、提取和檢測(cè)，因此其乙酸龍腦酯含量的比較仍然是有意義的。

3討論

砂仁是我國(guó)四大南藥之一，其主流品種為春砂仁，最近被廣東省列入立法保護(hù)的品種。對(duì)砂仁特別是陽(yáng)春砂仁原植物種質(zhì)資源進(jìn)行研究，對(duì)于中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究以三種陽(yáng)春砂栽培類型、海南砂及疑似陽(yáng)春砂栽培類型（錦秋）為研究材料，從表觀形態(tài)、遺傳距離分析等方面開展砂仁種質(zhì)資源的鑒定與親緣關(guān)系探討，以確認(rèn)錦秋是否為陽(yáng)春砂新栽培類型，為擴(kuò)大砂仁種質(zhì)資源利用打下基礎(chǔ)。

篩選出的三個(gè)引物擴(kuò)增后，多態(tài)性比率為91.2%，顯示該物種遺傳變異較高。遺傳距離顯示各個(gè)樣品間的相似系數(shù)均小于1.0，顯示有一定的遺傳距離，且五種砂仁種質(zhì)能用特定的引物將它們區(qū)分開來(lái)，說(shuō)明五種砂仁種質(zhì)是有差別的。聚類分析顯示樣品可分為3類，海南砂聚為一大類；長(zhǎng)果和圓果遺傳距離最小，可聚為一類；其次是仲華和錦秋，也可聚為一類；相對(duì)于海南砂，長(zhǎng)果、圓果、仲華與錦秋可總歸為一大類。聚類分析結(jié)果表明，錦秋是陽(yáng)春砂，是不同于已知三種栽培類型的新栽培類型。

五種砂仁種質(zhì)形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較也支持分子鑒定的結(jié)果。錦秋株高明顯大于其它三個(gè)陽(yáng)春砂栽培類型。其葉舌的長(zhǎng)度介于海南砂和長(zhǎng)果、圓果陽(yáng)春砂之間。錦秋葉緣具有雙邊波狀和單邊波狀兩種現(xiàn)象，而長(zhǎng)果、圓果陽(yáng)春砂都是雙邊波狀葉片，海南砂則是單邊波狀葉片。因而在葉片形態(tài)上，錦秋也表現(xiàn)出處于長(zhǎng)果、圓果與海南砂之間。在開花物候方面，錦秋的開花時(shí)間也處于長(zhǎng)果、圓果與海南砂之間。果實(shí)的性狀方面比較復(fù)雜，錦秋果實(shí)的形狀為胖圓形，這點(diǎn)與圓果、海南砂相似；顏色為黑褐色與海南砂相近，卻與長(zhǎng)果、圓果相區(qū)別，果實(shí)上的果刺形狀則與長(zhǎng)果、圓果相似。

錦秋與仲華的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.882 4，除果實(shí)形狀外的生物學(xué)性狀指標(biāo)都相似。其次與長(zhǎng)果的親緣關(guān)系較近，推測(cè)錦秋是長(zhǎng)果和仲華的雜交后代，或者是長(zhǎng)果與海南砂的雜交后代。據(jù)調(diào)查，陽(yáng)春市砂仁試驗(yàn)示范場(chǎng)于1979年引種海南砂，引種時(shí)與長(zhǎng)果栽培于同一場(chǎng)址，但分地塊單獨(dú)栽培。1986年后，由于示范場(chǎng)要改種其它經(jīng)濟(jì)樹，將長(zhǎng)果、圓果和海南砂混種于場(chǎng)址的一隅，這地點(diǎn)就是我們于2010年發(fā)現(xiàn)錦秋的區(qū)域。

錦秋的發(fā)現(xiàn)是因?yàn)樗幕ㄆ诤苓t，雖然我們也偶爾在秋天發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)果或圓果開花，但都是極個(gè)別的現(xiàn)象，如錦秋般遲花面積達(dá)到幾平方米的從未發(fā)現(xiàn)。然而，當(dāng)把錦秋移栽到廣州市大學(xué)城后，沒(méi)有在秋天發(fā)現(xiàn)開花。由于高速公路的建設(shè)，原來(lái)在陽(yáng)春市砂仁試驗(yàn)示范場(chǎng)發(fā)現(xiàn)錦秋的地點(diǎn)已被破壞，因而也無(wú)法重現(xiàn)發(fā)現(xiàn)地錦秋的花期。長(zhǎng)果和圓果在陽(yáng)春市的開花期一般早于廣州大學(xué)城10 d左右。因此，錦秋花期的大幅度提前的現(xiàn)象，是一個(gè)待研究的課題。

錦秋有質(zhì)量上的優(yōu)勢(shì)，雖然其果實(shí)小，但種子千粒重最大；由于砂仁的活性成分揮發(fā)油存在于種子中，因此錦秋的揮發(fā)油含量最高，但其乙酸龍腦酯含量與其它砂仁種質(zhì)無(wú)差異，提示它們間的化學(xué)成分組成不同。

培育高產(chǎn)品種是解決陽(yáng)春砂低產(chǎn)問(wèn)題的根本途徑，陽(yáng)春砂是典型的蟲媒植物，只有少數(shù)種類的昆蟲能為之授粉，培育可接受更多種類的昆蟲授粉的品種是一條提高產(chǎn)量的切實(shí)可行途徑（湯麗云等，2012）。能否接受更多種類的昆蟲授粉，與砂仁小花的形態(tài)，特別是與其假合蕊柱的挺直程度有關(guān)（何國(guó)振等，2014）。從形態(tài)觀察來(lái)看，錦秋的假合蕊柱的挺直程度與其它陽(yáng)春砂栽培類型或海南砂比較沒(méi)有肉眼可見的差異。海南砂的自然結(jié)實(shí)率為2%～33%（楊銳培等，2014），而陽(yáng)春砂的自然結(jié)實(shí)率為1.1%（彭建明等，2012），兩者存在一定的差異，我們推測(cè)導(dǎo)致這種差異的原因不是假合蕊柱的挺直程度的不同，而是花蜜量和成分的不同（陳紅，2015）。從海南砂的自然結(jié)實(shí)率略高于長(zhǎng)果等陽(yáng)春砂的結(jié)果，推測(cè)錦秋的自然結(jié)實(shí)率會(huì)高于長(zhǎng)果和圓果，具體情況如何有待將來(lái)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

致謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2012級(jí)學(xué)生黃杏協(xié)助完成五種砂仁植株的高度測(cè)量。

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