高效液相色譜法測定谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液中17種氨基酸

王平 陳南柱 鄭穗平

摘要[目的]建立一種簡單高效、可同時檢測發(fā)酵液中17種氨基酸的方法，并利用此方法對發(fā)酵液中的氨基酸進行定量分析。[方法]以2，4-二硝基氟苯為衍生試劑，使用Phenomenex Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃，流動相A為0.05 mmol/L乙酸鈉溶液，流動相B為乙腈-水（1∶1，V/V），梯度洗脫，檢測波長為360 nm。[結(jié)果]17種氨基酸在0.01～2.00 g/L線性相關良好，各相關系數(shù)在0.990以上，各氨基酸的加樣回收率為87.4%～105.1%。采用該方法對發(fā)酵液中的氨基酸進行分析，有10種氨基酸積累，其中谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸積累量較大。[結(jié)論] 該研究建立了一種簡單高效、可同時檢測發(fā)酵液中17種氨基酸的方法，為精氨酸進一步代謝改造提供理論依據(jù)。

關鍵詞氨基酸；高效液相色譜；柱前衍生；發(fā)酵液

中圖分類號S188+.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0026-03

Determination of 17 Amino Acids in Corynebacterium glutamicum Fermentation Broth by High Performance Liquid Chromatography

WANG Ping， CHEN Nanzhu， ZHENG Suiping

（School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract[Objective]A simple and efficient method for the simultaneous analysis of 17 free amino acids was established and applied to analyze free amino acids in Corynebacterium glutamicum. [Method] The method used precolumn derivatization with 2，4dintrofluorobenzene（DNFB）. The amino acids were separated in a Phenomenex Gemini NX C18 column （250.0 mm×4.6 mm，5 μm） at 30 ℃. The mobile phase was a mixture of phase A：0.05 mmol/L sodium acetate buffer （pH 6.8） and phase B∶1∶1（V/V） acetonitrile/water through the gradient elution. Detection was performed using a UV detector at 360 nm. [Result]The method showed good linearity with above correlation coefficients of 0990 when 17 kinds of amino acids concentrations were in the context of 0.01-2.00 g/L. The recoveries were between 87.4% and 1051%. Applying the method to analyze the fermentation broth ， it found that the broth had 10 kinds of amino acids accumulation and glutamic acid， citrulline and arginine among them accumulated a large amount. [Conclusion]The study establishes a simple and efficient method for the simultaneous analysis of 17 kinds of amino acids， provides theoretical basis for the metabolic transformation of the arginine.

Key wordsAmino acids；HPLC；Precolumn derivatization；Fermentation broth

作者簡介王平（1990—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向：氨基酸發(fā)酵及代謝工程。

收稿日期2017-01-10

精基酸是構成蛋白質(zhì)的氨基酸之一，是人體尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，是合成神經(jīng)組織中胍基丁酸的前體[1]，是機體內(nèi)運輸和儲存氮的重要載體[2]，被廣泛應用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)。精氨酸主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)[3]，生產(chǎn)菌株有枯草桿菌[4]、谷氨酸棒桿菌[5]、鈍齒桿菌[6]等。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液中除目的氨基酸外，還有各種氨基酸和一些有機酸，分析各種氨基酸的產(chǎn)量將有利于明確代謝流向，為進一步積累代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

氨基酸的定量分析方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜法、毛細血管法、氨基酸分析法等[7]。氨基酸分析儀是分析氨基酸的重要方法，但由于價格昂貴，使用受到限制。高效液相色譜結(jié)合柱前衍生的方法檢測氨基酸具有簡單、高效、成本低等特點，受到人們的關注。López-Cervantes等[8]采用芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）衍生氨基酸高效液相色譜法分析了蝦廢棄物蛋白水解物中16種氨基酸含量；于歡等[9]利用PITC柱前衍生高效液相色譜檢測了柴胡泡制前后的17種氨基酸含量；趙英蓮等[10]采用DNFB柱前衍生分析了樹莓中14種游離氨基酸含量；高年發(fā)等[11]利用DNFB柱前衍生高效液相色譜法測定了葡萄酒中23種氨基酸含量。

筆者采用DNFB柱前衍生，優(yōu)化液相條件，建立了谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液中瓜氨酸、鳥氨酸等17種氨基酸的分析方法，提高谷氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸等精氨酸合成途徑中中間產(chǎn)物的分離度，旨在為研究精氨酸合成途徑的代謝改造提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

Waters液相色譜儀（2695分離單元，2489紫外檢測器）；色譜柱：Phenomenex Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；離心機；電子天平；pH計；恒溫水浴鍋。

19種氨基酸標品（Sigma）：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、瓜氨酸（Cit）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Vla）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、鳥氨酸（Orn）、賴氨酸（Lys）；氫氧化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、冰醋酸、硼酸、硼砂為分析純；乙腈、水為色譜純。

1.2方法

1.2.1溶液配制。

pH 9.0 NaHCO3溶液：稱取4.2 g NaHCO3加水定容至100 mL。

pH 7.0 磷酸緩沖溶液：稱取3.4 g KH2PO4 轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，用約300 mL水溶解；取0.1 mol/L NaOH溶液7275 mL加入容量瓶中，混勻，再用水稀釋至刻度。

氨基酸標品：稱取氨基酸各200 mg，用pH 9.0的硼酸緩沖溶液溶解，定容至100 mL，作為母液，按比例混合即得到混標，4 ℃冰箱保存。

衍生試劑：取1 mL DNFB置于100 mL棕色容量瓶中，加乙腈定容，置于4 ℃冰箱避光保存。

流動相A：0.05 mol/L乙酸鈉緩沖溶液，含1%的N，N-二甲基甲酰胺，pH 6.8。稱取4.1 g無水乙酸鈉，溶于約950 mL水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6.8。加入10 mL N，N-二甲基甲酰胺，再定容至1 000 mL。用0.22 μm水相微孔濾膜過濾，并超聲脫氣10～20 min。

流動相B：乙腈水溶液（1∶1，V/V）。

1.2.2發(fā)酵液制備。

將谷氨酸棒桿菌ATCC 14067-pET-XK99E-argBH268E（過表達argB）在3 L發(fā)酵罐上進行補料發(fā)酵，發(fā)酵過程中定時取樣，1 200 r/min 離心5 min，取上清4 ℃保存。

1.2.3衍生反應。

取150 μL氨基酸標品加入到2 mL 離心管中，再加入150 μL pH 9.0 NaHCO3混勻，加入150 μL DNFB溶液，放入60 ℃水浴鍋中，暗處反應60 min。取出冷卻至室溫，加入1 050 μL 平衡緩沖溶液（pH 7.0 磷酸溶液），靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，取過濾液1 000 μL。

1.2.4色譜條件。

色譜柱：Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.05 mol/L乙酸鈉緩沖溶液（pH 68）；流動相B：乙腈水溶液；流量：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm。洗脫程序見表1。

2結(jié)果與分析

2.1液相條件優(yōu)化

對Agilent SB C18 （150.0 mm×4.6 mm，5 μm）、Hypersil BDS C18（250.0 mm×4.6 mm， 5 μm）和Gemini NX C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Agilent SB C18柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果較差，Cit、Gly、Arg、Thr、Pro、Ala較集中，難以分開。而Hypersil BDS C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）比Agilent SB C18（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）柱長，分離效果明顯較好，但Arg、Thr難以分開。而Gemini NX C18（150.0 mm×4.6 mm，

5 μm）對17種氨基酸的分離效果較好，但有些峰太近，需進一步優(yōu)化。

對其洗脫程序進行優(yōu)化，將有重疊的峰盡可能分開，首先將流動相B的比例設為15%，0～22 min，流動相B逐步變?yōu)?0%，減小溶劑峰DNP-OH對Asn和Gln的干擾，有利于Cit與Gly、Arg的分離；22～30 min，流動相B變?yōu)?0%，將Pro和Ala分開；30～34 min，流動相B快速變?yōu)?0%，縮短分析時間；34～38 min，流動相B變?yōu)?0%，促進Val和Met的分離；38～50 min，流動相B變?yōu)?0%，有利于Leu、Ile和Trp、Orn、Lys和NH+4的分離。為了沖掉殘留在柱中的雜質(zhì)以及使柱子恢復到初始狀態(tài)，有利于下一個樣品的穩(wěn)定性，對溫度、pH等進行優(yōu)化確定最佳色譜條件。優(yōu)化后的結(jié)果見圖1。由圖1可知，除Gln受到溶劑峰DNP-OH的干擾，Phe和His重合外，其他16種氨基酸的分離效果較好。

2.2線性關系

將氨基酸母液用硼酸緩沖液稀釋，得到不同質(zhì)量濃度的氨基酸標準液，按“1.2.3”方法衍生反應，靜置離心，過濾后，進行液相分析，得到17種氨基酸的線性關系范圍，其相關系數(shù)均大于0.990，說明在設定范圍內(nèi)線性關系良好（表2）。

2.3精密度

取氨基酸混標，按“1.2.3”方法衍生分析，進樣6次檢測，計算各氨基酸峰面積的相對標準偏差，結(jié)果顯示，Asp的RSD為1.29%，Glu的RSD為1.33%，Asn的RSD為1.32%，Gln的RSD為1.79%，Cit的RSD為1.42%，Gly的RSD為1.22%，Arg的RSD為1.27%，Thr的RSD為132%，Pro的RSD為1.35%，Ala的RSD為1.35%，Val的RSD為1.38%，Met的RSD為1.30%，Ile的RSD為1.51%，Leu的RSD為1.29%，Trp的RSD為1.35%，Orn的RSD為1.20%，Lys的RSD為1.34%。說明該儀器的精密度良好，滿足分析要求。

2.4重復性

將發(fā)酵液分成6份按“1.2.3”方法衍生分析，計算各氨基酸峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，Asp的RSD為1.20%，Glu的RSD為1.30%，Gln的RSD為2.79%，Cit的RSD為0.90%，Gly的RSD為1.49%，Arg的RSD為193%，Thr的RSD為3.77%，Pro的RSD為1.60%，Ala的RSD為2.03%，Orn的RSD為1.89%，Lys的RSD為2.20%。 說明用該方法處理樣品，重復性良好。

2.5穩(wěn)定性

取發(fā)酵液按“1.2.3”方法衍生分析，并在0、2、4、8、12、16、24 h進樣，計算各峰的RSD，結(jié)果顯示Asp的RSD為3.48%，Glu的RSD為0.89%，Gln的RSD為2.87%，Cit的RSD為0.86%，Gly的RSD為1.09%，Arg的RSD為095%，Pro的RSD為0.85%，Ala的RSD為0.80%，Orn的RSD為0.69%，Lys的RSD為0.90%。說明在24 h內(nèi)，樣品穩(wěn)定性較好。

2.6回收率

取已知含量的發(fā)酵液6份，分別加入一定濃度的氨基酸標樣混合溶液，按“1.2.3”方法衍生分析，計算各氨基酸的回收率，結(jié)果顯示，Asp的RSD為99.4%，Glu的RSD為934%，Gln的RSD為90.2%，Cit的RSD為87.4%，Gly的RSD為96.0%，Arg的RSD為88.1%，Pro的RSD為97.1%，Ala的RSD為105.1%，Orn的RSD為94.7%，Lys的RSD為96.3%，回收率在87.4%～105.1%，滿足分析要求。

2.7樣品含量

分別對42、48、54 h的發(fā)酵液離心取上清，并稀釋一定倍數(shù)，按“1.2.3”方法衍生分析，樣品峰圖見圖2。對結(jié)果進行外標法定量，結(jié)果見表3。由表3可知，發(fā)酵液中氨基酸主要有Asp、Glu、Gln、Cit、Gly、Arg、Pro、Ala、Orn、Lys 10種。不同氨基酸的積累量差異較明顯，其中Glu、Cit、Arg積累量較多，Gly、Ala、Orn、Lys次之，Asp、Gln、Pro很少。其中精氨酸合成途徑的中間物質(zhì)瓜氨酸積累量較大，沒有快速轉(zhuǎn)化為精氨酸，即精氨酸合成途徑中瓜氨酸到精氨酸的轉(zhuǎn)化效率需加強。

3結(jié)論

該方法很好地將17種氨基酸進行了分離，可同時分析17種氨基酸，且分析范圍廣，達0.01～2.00 g/L，樣品處理簡單，為發(fā)酵液的分析提供了簡單有效的方法。同時，將此方法用于分析谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)Glu、Cit、Arg等大量積累，為精氨酸進一步代謝改造提供理論依據(jù)。

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