草魚模擬腸液的開發(fā)及其在仿生消化儀上的應(yīng)用

溫偉辛 徐樹德 胡毅

摘要[目的]研制草魚模擬腸液配方。[方法]根據(jù)草魚成魚的腸道淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，pH以及鈉離子環(huán)境，研制了一套草魚成魚的模擬腸液配方，并研究其在仿生消化儀上的應(yīng)用。[結(jié)果]利用配制的草魚模擬腸液進(jìn)行體外仿生消化試驗，發(fā)現(xiàn)飼料中干物質(zhì)和粗蛋白的消化率與真實值的絕對差值均在10%左右，達(dá)到仿生消化的目的與要求。此外，經(jīng)過仿生消化，外源植酸酶能夠顯著提高干物質(zhì)消化率、粗蛋白消化率和代謝能值，促進(jìn)植酸磷的釋放。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為草魚的體外模擬消化提供更可靠的試驗數(shù)據(jù)，并為水產(chǎn)其他動物模擬腸液的開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞草魚；仿生消化儀；模擬腸液；營養(yǎng)物質(zhì)消化率；代謝能值

中圖分類號S931文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0110-03

Development of Simulated Intestinal Fluid of Ctenopharyngodon idellus and Its Application in Simulated Digesting Apparatus

WEN Weixin1，XU Shude1，2，HU Yi1

（1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；2.Fisheries College of Ocean University of China/ Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds，Ministry of Agriculture/ Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Qingdao，Shandong 266003）

Abstract[Objective] To develop the formula of simulated intestinal fluid of Ctenopharyngodon idellus.[Method] According to the activities of amylase，trypsin and chymotrypsin，pH and sodium ion environment in the intestines of C.idellus adult，a formula of simulated intestinal fluid for C.idellus adult was developed.And its application in simulated digesting apparatus was studied.[Result] Through in vitro simulated digestion experiment of prepared simulated intestinal fluid of C.idellus，it was found that the absolute difference between the digestibility of dry matter and crude protein in feed and true values were about 10%，which met the purpose and requirements of simulated digestion.In addition，after the simulated digestion，exogenous phytase could significantly increase dry matter digestibility，crude protein digestibility and metabolic energy，and promote the release of phytate.[Conclusion] The research results can provide more reliable experimental data for in vitro simulation and digestion of C.idellus and provide references for the development of simulated intestinal fluid in other aquatic animals.

Key wordsCtenopharyngodon idellus；Simulated digesting apparatus；Simulated intestinal fluid；Digestibility of nutrient；Metabolizable energy value

自20世紀(jì)60年代以來，為了開發(fā)對飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價的快速評定技術(shù)，各國學(xué)者在離體法、原位法以及生物學(xué)法的簡化方面進(jìn)行了大量研究。20世紀(jì)90年代中期，歐洲國家以三角瓶為模擬消化器，采用以胃蛋白酶、胰液素為模擬消化液酶液的體外法測定豬飼料的消化能值。但是，上述方法有諸多因素容易導(dǎo)致系統(tǒng)誤差，如飼料粉碎粒度、消化酶與樣品的比例、緩沖液pH、酶促反應(yīng)溫度、水解時間、未消化殘渣的分離、殘渣過濾后脂肪在濾紙中的殘留等[1-2]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所開發(fā)的仿生消化儀，近幾年在國內(nèi)大型飼料企業(yè)和添加劑公司得到了應(yīng)用與推廣。目前，仿生消化儀主要應(yīng)用在畜禽上[1，3]，而仿生消化儀在水產(chǎn)動物上的應(yīng)用報道較少。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一，其食性隨著草魚的生長發(fā)育而改變，能利用植物性和動物性2類餌料[4-5]。市場上草魚飼料種類繁多，而草魚對不同飼料的利用率、添加酶制劑是否能夠促進(jìn)草魚對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收都有待進(jìn)一步研究。筆者利用常規(guī)生化方法對草魚腸液進(jìn)行模擬，開發(fā)了一套草魚模擬腸液配方，并在仿生消化儀上進(jìn)行了應(yīng)用，旨在為草魚的體外模擬消化提供更可靠的試驗數(shù)據(jù)，也為其他水產(chǎn)動物模擬腸液的開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1取樣。2013年9月7日在珠海斗門白蕉某草魚養(yǎng)殖池塘進(jìn)行取樣，投喂飼料30 min內(nèi)立即隨機(jī)挑選8尾草魚，平均體重1.9 kg，平均體長43.4 cm。稱重、測量體長后迅速進(jìn)行解剖，取其腸組織，液氮中運輸并保存在-65 ℃超低溫冰箱中，備用。

1.1.2樣品處理。

1.1.2.1腸黏液上清的制備。

于冰盤內(nèi)剔除腸周圍殘余脂肪，剪開腸道，分別收集前腸、后腸內(nèi)黏液，再用預(yù)冷生理鹽水沖去內(nèi)容物，用濾紙輕輕擦干，稱量前腸重、后腸重。使用pH計分別測定前腸、后腸黏液以及食糜的pH。腸黏液在4 ℃、11 000 r/min條件下離心20 min后，取上清1 mL，加入預(yù)冷的生理鹽水，稀釋至10 mL，24 h內(nèi)測定其淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性。

1.1.2.2腸組織粗酶液的制備。

取前腸、后腸各1 g，加入9倍質(zhì)量的預(yù)冷生理鹽水，用高速勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，倒入10 mL的離心管中，4 ℃、11 000 r/min條件下離心20 min，24 h內(nèi)測定其主要消化酶活性。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑。福林-酚試劑（4 ℃下保存）、0.55 mol/L碳酸鈉溶液、10%三氯乙酸溶液、0.20 mol/L磷酸緩沖液、0.5%干酪素溶液、100 μg/mL酪氨酸溶液（4 ℃下保存）、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、植酸酶、淀粉酶[型號A3306，購自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司]、胰蛋白酶（型號0785，購自美國Amresco股份有限公司）、糜蛋白酶（型號0164，購自美國Amresco股份有限公司）、淀粉酶測試盒、糜蛋白酶測試盒（南京建成生物科技有限公司）以及Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2.2主要儀器。SDS-2仿生消化儀、島津UV-1800分光光度計、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、分析天平、pH計、勻漿器、干燥器以及滴定管等。

1.3方法

1.3.1腸黏液和組織中淀粉酶活力的測定。使用淀粉酶測試盒，測定腸黏液和組織中淀粉酶活力。①腸黏液淀粉酶活力。取100 mL腸黏液上清，在25 ℃、pH 7.05條件下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個酶活單位。按照以下公式計算腸黏液中淀粉酶活力：

淀粉酶活力（U/mL）=（空白OD值-測定OD值）/空白OD值×80×稀釋倍數(shù)。②腸組織中淀粉酶活力。腸組織中每毫克蛋白在25 ℃、pH 7.05條件下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個酶活單位。按照以下公式計算腸組織中淀粉酶活力：淀粉酶活力（U/mg prot）=（空白OD值-測定OD值）/空白OD值×08/待測樣本蛋白濃度。

1.3.2腸黏液和組織中胰蛋白酶活力的測定。

各試管中加入0.5%酪素2 mL，于37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，然后加入10%三氯乙酸3 mL，經(jīng)過濾除去沉淀，取清液1 mL，加入055 mol/L碳酸鈉溶液5 mL，再加入福林試劑1 mL，于37 ℃水浴中顯色15 min，測定OD680值。以光密度為縱坐標(biāo)，以酪氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。①腸黏液中胰蛋白酶活力。每毫升腸黏液上清在25 ℃、pH 7.05條件下每分鐘分解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。按照以下公式計算腸黏液中胰蛋白酶活力：胰蛋白酶活力（U/mL）=（生成的酪氨酸質(zhì)量/15）×酶液稀釋倍數(shù)。②腸組織中胰蛋白酶活力。每毫克腸組織蛋白在25 ℃、pH 7.05條件下每分鐘分解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。按照以下公式計算腸組織中胰蛋白酶活力：胰蛋白酶活力（U/mg prot）=（生成的酪氨酸質(zhì)量/15）/待測樣本蛋白濃度×加樣體積。

1.3.3腸黏液和組織中糜蛋白酶活力的測定。使用糜蛋白酶測試盒，測定腸黏液和組織中糜蛋白酶活力。

①腸黏液中糜蛋白酶活力。每毫升腸黏液上清在25 ℃、pH 7.05條件下每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個酶活力單位。按照以下公式計算腸黏液中糜蛋白酶活力：糜蛋白酶活力（U/mL） = （測定OD值-對照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/（10×0.64/0.04）×10。②腸組織中糜蛋白酶活力。每毫克腸組織蛋白在25 ℃、pH 7.05條件下每分鐘分解蛋白生成1 μg氨基酸相當(dāng)于1個酶活力單位。按照以下公式計算腸組織中糜蛋白酶活力：糜蛋白酶活力（U/mg prot）= （測定OD值-對照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/（10×0.64/0.04）/待測樣本蛋白濃度。

1.3.4前腸、后腸黏液中Na+濃度的測定。

采用酸堿滴定法滴定腸液中Na2HPO4和NaH2PO4濃度來反映Na+濃度。用NaOH準(zhǔn)確滴定H2PO4-，用酚酞作為指示劑，滴定終點由無色變?yōu)槲⑺{(lán)色。由于Na2HPO4的Ka3很小，不能直接連續(xù)滴定，用鹽酸滴定HPO42-，用甲基橙作為指示劑，終點時溶液由紅色變?yōu)辄S色。

1.3.5草魚模擬腸液在仿生消化儀上的應(yīng)用。

根據(jù)測定腸液中的酶活力、pH以及Na+濃度，以SDS-2仿生消化儀及相關(guān)技術(shù)為依托，配制基于該仿生消化儀的草魚模擬腸液。按照該系統(tǒng)操作規(guī)程（略有改進(jìn)），對配制的草魚模擬腸液進(jìn)行一系列仿生消化試驗。

1.3.5.1草魚幼魚、成魚飼料的仿生消化評估。分2批進(jìn)行試驗，試驗均在仿生消化儀上進(jìn)行。試驗1分為2組，每組5個重復(fù)，第1組為A公司草魚成魚沉水料638（粗蛋白含量22%），第2組為A公司草魚成魚膨化料6636（粗蛋白含量26%）。試驗2同樣分為2組，每組5個重復(fù)，第1組為B公司草魚幼魚沉水料，第2組為B公司草魚幼魚膨化料。2批試驗均利用配制的模擬腸液分別對草魚幼魚和成魚飼料進(jìn)行模擬消化。仿生消化儀的酶液反應(yīng)溫度設(shè)為25 ℃。

1.3.5.2外源酶制劑 （植酸酶）對飼料消化利用率的影響。

試驗分為2組，每組5個重復(fù)，第1組為對照組，第2組為加酶組，在對照組的基礎(chǔ)上添加300 g/t的植酸酶（2 000 U/g，粉劑）。利用仿生消化儀評估外源植酸酶對A公司草魚成魚顆粒料639（粗蛋白含量25%）中營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率的影響。

1.4數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差異顯著；采用Duncans方法進(jìn)行多重比較分析。試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1草魚人工模擬腸液配方試驗結(jié)果表明，草魚前腸、后腸淀粉酶和糜蛋白酶活性均無顯著差異，但前腸胰蛋白酶活性顯著高于后腸胰蛋白酶活性（P<0.05）。

通過對草魚腸液進(jìn)行人工模擬，得到草魚模擬腸液的配方：分別稱取淀粉酶152.025 kU、胰蛋白酶45.959 kU以及糜蛋白酶12.893 kU，將三者溶解于250 mL去離子水中，緩慢攪拌直至完全溶解（勿在加熱板上加熱）。進(jìn)行仿生試驗時，透析袋中模擬腸液的總體積為20 mL，若需添加外源酶，按酶的推薦添加量折算成體積2 mL進(jìn)行添加。

2.2草魚人工模擬腸液的pH

使用pH計分別測定草魚前腸黏液、后腸黏液的pH，結(jié)果表明前腸黏液pH為6.95，后腸黏液pH為6.92。前腸、后腸食糜的平均pH為7.05，為腸道消化酶反應(yīng)時的pH環(huán)境，因此該試驗中腸道消化酶測定時pH均為7.05。

2.3草魚模擬腸液中的Na+濃度

2.3.1腸黏液中磷酸二氫鈉的濃度。

通過滴定發(fā)現(xiàn)，磷酸二氫鈉在前腸和后腸黏液中的濃度分別為0.187和0.199 mol/L。因此，在配制仿生消化試驗磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液時，前腸、后腸分別稱取無水磷酸二氫鈉44.89和47.76 g，定容至2 000 mL容量瓶中，25 ℃條件下調(diào)節(jié)溶液pH至6.95。

2.3.2腸黏液中磷酸氫二鈉的濃度。

通過滴定發(fā)現(xiàn)，磷酸氫二鈉在前腸和后腸黏液中的濃度分別為0.357和0.352 mol/L。因此，在配制仿生消化試驗磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液時，前腸、后腸分別稱取無水磷酸氫二鈉10148和100.06 g，定容至2 000 mL容量瓶中，25 ℃條件下調(diào)節(jié)溶液pH至6.92。

2.4草魚模擬腸液在仿生消化儀上的應(yīng)用

2.4.1草魚模擬腸液對草魚幼魚、成魚沉水料和膨化料的仿生消化試驗。

模擬腸液對A公司的2種草魚成魚飼料和B公司的2種草魚幼魚飼料中干物質(zhì)、粗蛋白消化率和代謝能值的影響分別見表1和表2。由表1、表2可知，A公司草魚成魚膨化料6636組干物質(zhì)消化率、粗蛋白消化率以及代謝能值均顯著高于沉水料638組（P<0.05）。A公司草魚幼魚膨化料組干物質(zhì)、粗蛋白消化率及代謝能值也顯著高于幼魚沉水料組（P<0.05）。一般而言，在不同生物學(xué)方法條件下飼料代謝能的測定值與“真實值”的差值不低于10%的定量水平[6]。張子儀等[7]研究表明，在不同飼料組合條件下，同一飼料原料雞代謝能值的絕對差值在10%以上。該研究結(jié)果表明干物質(zhì)和粗蛋白的消化率與真實值的絕對差值均在10%左右，能夠達(dá)到仿生消化的目的與要求，這說明該研究中草魚模擬腸液配方能夠較好地模擬草魚腸道消化。

2.4.2外源酶制劑植酸酶對草魚成魚沉水料仿生消化的影響。

由表3可知，加酶組干物質(zhì)、粗蛋白消化率及代謝能值均顯著高于對照組（P<0.05），干物質(zhì)消化率提高了約1%，粗蛋白消化率提高了3.5%，代謝能值提高了1.38 MJ/kg。這表明添加外源植酸酶可以顯著提高草魚成魚飼料的營養(yǎng)物質(zhì)利用率。

3結(jié)論

（1）筆者對配制的草魚模擬腸液在仿生消化儀的應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明飼料中干物質(zhì)和粗蛋白的消化率與真實值的絕對差值均在10%左右，達(dá)到仿生消化的目的與要求，說明該草魚模擬酶液能夠用于仿生消化系統(tǒng)的體外模擬消化。

（2）仿生消化試驗表明，外源添加植酸酶能夠顯著提高干物質(zhì)、粗蛋白消化率以及代謝能值。

（3）通過對商品飼料的仿生消化試驗表明，膨化料干物質(zhì)和粗蛋白的消化率均在70%以上，代謝能值達(dá)到（13.97±0.30）MJ/kg，明顯高于沉水料，但外源酶制劑是否在沉水料中應(yīng)用更有效果尚有待深入研究。

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