復方黃櫨口服液中總黃酮含量測定方法

郝少君，李文俊，高延玲，蘇 峰，張正臣

復方黃櫨口服液為臨床應用多年的中藥制劑，由黃櫨、五味子、垂盆草、枸杞、梔子、大棗等六味中藥組成。除濕清熱，退黃降酶，用于急性黃疸型肝炎，慢性肝炎。文獻報道［1］，黃櫨所含的黃酮類、多酚類等物質(zhì)可用于高血壓、黃疸性肝炎等的防治；五味子富含黃酮類木脂素、多糖、揮發(fā)油及其他多種化學成分，具有保肝益腎、保護心腦血管、鎮(zhèn)靜、催眠等多種功能［2，3］；垂盆草［4］主要含有糖類、黃酮類、三帖類及苷類成分，垂盆草總黃酮［5］是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一，且垂盆草總黃酮至少含有槲皮素、山柰素、木犀草素等8種黃酮類化合物；寧夏枸杞［6］的主要活性成分含量——枸杞多糖、總糖、甜菜堿；梔子［7］的化合物有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機酸酯類、多糖類、醛類、醇類、長鏈烷烴類等；大棗［8］主要成分為糖類、有機酸及其酯類、皂苷類、生物堿類、黃酮類等。

以上可知，黃酮類成分為方中的主要有效成分。該文以蘆丁為對照品，利用黃酮類化合物的3，5－羥基與Al3+生成絡合物，在可見光區(qū)有最大吸收的特點，采用紫外分光光度法［9－14］測定黃酮的含量，為建立該復方黃櫨口服液的質(zhì)量標準提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 752N紫外可見分光光度計 （上海精密科學儀器有限公司）；AB135－S電子天平 （梅特勒－托利多集團）。

1.2 試藥 蘆丁對照品 （批號：100080－201409 CAS號：153－18－4）購自中國食品藥品檢定研究院；水為純化水；其他試劑均為分析純。復方黃櫨口服液（批號：20150608、20150712、20150820）由該院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品50 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加70%乙醇20 ml，置水浴上微熱使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得對照品溶液（每1 ml含蘆丁0.2 mg）。

2.2 供試品溶液的制備 精密量取復方黃櫨口服液5 ml，置 50 ml量瓶中，加70%乙醇40 ml，置水浴上微熱使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 檢測波長的選擇 精密量取對照品溶液1 ml，置于25 ml容量瓶中，加水5 ml，加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置6 min，后加入10%硝酸鋁溶液1 ml，混勻，放置6 min，再加入10 ml氫氧化鈉試液，加水至刻度，搖勻，放置15 min，同時以相應的試劑做空白對照，照紫外－可見分光光度法，測定波長在400～600 nm區(qū)段內(nèi)的吸光度，結果在505 nm波長處有最大吸收，因此選定510 nm為檢測波長。

2.4 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分別置 25 ml量瓶中，各加水至6.0 ml，加 5%亞硝酸鈉溶液1 ml，混勻，放置6 min，加 10%硝酸鋁溶液 1 ml，混勻，放置 6 min，加氫氧化鈉試液（取氫氧化鈉4.3 g，加水使溶解成100 ml，即得）10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min；以相應的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法，在505 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=9.5385C+0.097（r=0.9997），表明蘆丁在8～48 μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5 總黃酮含量測定 精密量取供試品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照“標準曲線的繪制”項下的方法，自“加水至6.0 ml”起依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算即得。平行測定3次，結果三批復方黃櫨口服液的總黃酮含量平均為32.75 mg/ml。結果見表1。

表1 復方黃櫨口服液中總黃酮的含量測定（n=3）

2.6 精密度試驗 精密量取同一批 （批號：20150820）樣品供試品溶液2 ml，按照“標準曲線的繪制”項下方法，自“加水至6.0 ml”起依法測定吸光度A值，平行測定5次。結果見表2。表明本方法精密度良好。

表2 復方黃櫨口服液的精密度試驗（n=5）

2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（批號：20150820）2 ml，按照“標準曲線的繪制”項下方法，自“加水至6.0 ml”起，依法顯色后放置不同時間進行測定，每隔5 min測定1次吸光度。結果見表3。

表3 復方黃櫨口服液的穩(wěn)定性試驗結果

結果測得的RSD值為0.64%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取復方黃櫨口服液樣品，分別精密量取本品5 ml，共5份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.5”項下方法，依法顯色后測定總黃酮含量，結果RSD為1.67%，表明該方法的重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液（0.3184 mg/ml）共 6份各 1 ml，分別精密加入不同量的對照品溶液（0.2 mg/ml），照“標準曲線的繪制”項下的方法，自“加水至6.0 ml”起依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的量，計算回收率。結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果

結果該方法的平均回收率為99.38%，RSD為1.57%。

3 討論

甲、乙、丙型肝炎損害肝功能、危及生命、易引起并發(fā)癥，是法定乙類傳染病，具有傳染性較強、傳播途徑復雜、流行面廣泛、發(fā)病率高等特點。目前雖然有一些中、西藥治療方式，但是療效仍不理想，不能較好的治療各型肝炎且有不同程度的不良反應，給患者帶來較大的痛苦。西藥雖見效快，但不良反應大，亦有導致中斷治療的現(xiàn)象。鑒于此根據(jù)多年的臨床實踐經(jīng)驗，該方劑由筆者所在醫(yī)院藥械科與肝病科合作，研制了復方黃櫨口服液，方由黃櫨、五味子、垂盆草、枸杞、梔子、大棗等六味中藥組成。

方中黃櫨［15，16］清熱解毒，散瘀鎮(zhèn)痛，具有抗菌消炎、退熱消腫等功效，含有黃酮、沒食子酸等多種化學成分，也是我國傳統(tǒng)藥用植物，可用于治療黃疸型肝炎、水火燙傷、感冒、牙齦炎，為君藥。五味子［17］可斂肺滋腎，生津斂汗，澀精止瀉，寧心安神，降低血清轉(zhuǎn)氨酶，保肝利膽，能增加機體對非特異性刺激的防御能力；垂盆草具有清熱解毒、清利濕熱的功效，有文獻報道垂盆草有保肝降酶的作用，并證實了垂盆草的保肝降酶的主要活性成分存在于苷類和總黃酮，而垂盆草顆粒是由鮮垂盆草經(jīng)提取、制粒制備而成的中成藥，用于急慢性肝炎濕熱瘀結證，以上二味藥為臣藥。枸杞子能補血明目，為滋陰助陽，益精補血之良藥；梔子［18］具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效，主治熱病心煩，肝火目赤，頭痛，濕熱黃疳，藥理作用表明梔子具有抗氧化、抗炎、抗自由基損傷、促進膽汁分泌、抗病毒、保護神經(jīng)細胞等作用，以上二藥為佐藥。大棗可補中益氣，養(yǎng)血安神，緩和藥性，有提高體內(nèi)單核－吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能，保護肝等作用，為使藥。諸藥合用，以達到除濕清熱、退黃降酶的作用，用于急性黃疸型肝炎，慢性乙型肝炎。

該實驗首次從復方黃櫨口服液中提取出總黃酮并測定了其含量，為建立該制劑的質(zhì)量標準提供了理論依據(jù)。結果表明，利用紫外分光光度法對復方黃櫨口服液中總黃酮含量進行測定，實驗條件容易控制，操作簡單，重現(xiàn)性好，可作為測定黃酮類化合物的常用方法。

在該實驗中采用硝酸鋁作為黃酮類物質(zhì)比色測定的顯色劑，主要是因為黃酮母核中含有堿性氧原子，一般又多帶酚羥基，能和鋁離子產(chǎn)生黃色絡合物。加入亞硝酸鈉和氫氧化鈉，可使之在堿性溶液中顯紅色，顯色反應要及時測定，放置過久易褪色。

參考文獻

［1］陶 峰，顏仁杰，周海鳳，等.黃櫨化學成分與藥理活性研究進展［J］. 世界臨床藥物，2014，35（2）：109－112.

［2］史 琳，王志成，馮敘橋，等.五味子化學成分及藥理作用的研究進展［J］. 藥物評價研究，2011，34（3）：208－212.

［3］孔華麗，閆 亮，段惠娟，等.五味子醇提取物保肝作用成分分析［J］. 解放軍藥學學報，2010，26（1）：26－29.

［4］郭 輝，張 玲.垂盆草化學成分和藥理作用的研究進展［J］.食品與藥品，2006，8（1）：19－22.

［5］潘金火，潘 萍.垂盆草總黃酮中 8種單體成分對肝細胞的保護作用［J］. 中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30（19）：1621－1623.

［6］王 歡，金哲雄，溫美佳，等.不同產(chǎn)地寧夏枸杞活性成分比較研究［J］. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28（6）：21－25.

［7］任治軍，張立明，何開澤.梔子主要成分的提取工藝及藥理研究進展［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（6）：821－836.

［8］張 采，李 佳，張永清.大棗化學成分研究概況［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13（11）：49－51.

［9］沈廣志，郭 強，何志鵬.分光光度法測定大棗中總黃酮含量［J］.微量元素與健康研究，2011，28（4）：26－27.

［10］宋文曙.分光光度法測定復方山楂口服液中總黃酮的含量［J］.中國藥師，2009，12（2）：253－254.

［11］宋琳琳，沙靖全，趙 宏，等.冬奇子口服液總黃酮含量測定及穩(wěn)定性研究［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2016，18（5）：75－77.

［12］閆建偉，倪天軍，董 麗，等.柴胡口服液中總黃酮含量測定［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2007，24（1）：36－38.

［13］潘金火，潘 萍.垂盆草總黃酮的保肝降酶作用及其化學成分的鑒別研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1930－1934.

［14］董靜洲，王 瑛.寧夏枸杞主要產(chǎn)區(qū)枸杞子總黃酮的測定與分析研究［J］. 食品研究與開發(fā)，2009，30（1）：36－40.

［15］王 剛，王 保，杜士明，等.正交設計優(yōu)選黃櫨總黃酮提取工藝［J］. 中國藥師，2013，16（4）：511－514.

［16］張?zhí)忑垼?昂，鞏 江，等.黃櫨藥學研究概況［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13（4）：75－76.

［17］ 廖夫生. 中藥梔子研究進展［J］. 廣州化工，2013，41（1）：12－13.

［18］宮 莉，李彤輝，包 雪，等.北五味子黃酮提取及其生物活性研究［J］. 長春工業(yè)大學學報，2015，36（5）：556－561.