實驗小鼠血清中酯酶-1的檢測能力驗證結(jié)果評價

魏 杰，王 洪，鞏 薇，于鵬麗，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

研究報告

實驗小鼠血清中酯酶-1的檢測能力驗證結(jié)果評價

魏 杰，王 洪，鞏 薇，于鵬麗，岳秉飛*

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 通過實驗小鼠血清中酯酶-1項目的檢測比對，促進(jìn)全國實驗動物質(zhì)量檢測實驗室加強質(zhì)控管理，提升檢測能力。方法 按標(biāo)準(zhǔn)程序制備能力驗證樣品，隨機編號，冷鏈運輸發(fā)放給參加單位。參與者在規(guī)定時限提交檢驗結(jié)果和原始記錄復(fù)印件。所得結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果完全一致的判為滿意結(jié)果，否則為不滿意結(jié)果。結(jié)果 共11個實驗室報名參加本次比對試驗，其中滿意結(jié)果的有10個實驗室，占參加比對實驗室的90.9%；不滿意結(jié)果1個實驗室，占參加比對實驗室的9.1%。結(jié)論 本次能力驗證項目反映出各參與實驗室在實驗小鼠腎勻漿中酯酶-1的總體檢測水平較高，但仍需注重標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范和檢測細(xì)節(jié)。

能力驗證；質(zhì)量控制；酯酶-1

血清酯酶-1及其同工酶在實驗動物的免疫防御、遺傳育種及特性篩選發(fā)揮著重要作用[1-3]。在國家標(biāo)準(zhǔn)近交系大小鼠的遺傳檢測中，均有酯酶-1項目的檢測要求[4]。該位點多態(tài)性明確，結(jié)果容易判斷，是近交系大小鼠的遺傳監(jiān)測中不可或缺的指標(biāo)之一。

實驗室間的能力驗證(proficiency testing)是一種國際通行的實驗室質(zhì)量控制方法，在評價實驗室的工作能力，加強實驗室的質(zhì)控管理及提升實驗室的檢測水平等方面具有積極的意義與影響[5]。中國食品藥品檢定研究院一直致力于推進(jìn)實驗室間的能力驗證評價工作。2013年開始與中國合格評定國家認(rèn)可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS)合作，組織開展全國范圍實驗室能力驗證活動；2014年獲得能力驗證提供者資質(zhì)，在CNAS的監(jiān)督指導(dǎo)下，獨立組織實施能力驗證項目。歷經(jīng)三年的積累，僅在實驗動物遺傳檢測能力驗證項目上，已完成了堿性磷酸酶-1等4個項目的比對[6-8]。為進(jìn)一步提升不同實驗室的管理檢測水平，發(fā)現(xiàn)和解決實際工作中的問題，2016能力驗證計劃NIFDC-PT-086 “實驗小鼠血清中酯酶-1的檢測”落地實施。

1 材料和方法

1.1 比對樣品的制備

本項目提供的待測樣為小鼠血清凍干樣品。BALB/c、C57BL/6兩個品系小鼠各20只，8周齡，均來自中國食品藥品檢定研究院【SCXK(京)2014-0013】。動物取材實驗均在中國食品藥品檢定研究院動物設(shè)施內(nèi)完成【SYXK(京)2011-0008】。小鼠眼球采血并分離血清，按照品系分別稱取實驗動物血清總重量，加入一定比例的蔗糖溶液作為保護(hù)劑混勻，按照50 μL/管的裝量分裝，放入-20℃冰箱中冷凍2 h，置于凍干機中凍干。所制樣品均需進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗。

1.2 均勻性檢驗

根據(jù)樣品數(shù)量，隨機抽取4%的樣品進(jìn)行均勻性檢驗。共抽樣6管，每品系3管，實驗條件參見GB/T14927.1-2008。各樣品實驗時均需加入50 μL蒸餾水進(jìn)行還原。如所得基因型與標(biāo)準(zhǔn)基因型保持一致，且清晰可讀，即認(rèn)為符合樣品的均勻性要求。否則需重新制樣檢測直至合格，備用于穩(wěn)定性實驗和樣品發(fā)放。本研究中所制樣品均滿足均勻性要求。結(jié)果參加圖1。

1.3 穩(wěn)定性檢驗

1.3.1 存放穩(wěn)定性檢驗

分別將時間和溫度設(shè)為觀測的橫縱坐標(biāo)，設(shè)定4℃、室溫(RT)這2個溫度觀測點，1、3、7、14、30 d為觀測時間，在每個坐標(biāo)交點，每個型別的樣品分別隨機抽取1管進(jìn)行編號。如發(fā)現(xiàn)任何1管發(fā)生條帶模糊不可讀，則認(rèn)為在該點已經(jīng)發(fā)生了樣品的穩(wěn)定性變化，即在該時間溫度條件下該型別樣品不穩(wěn)定。記錄各型別不穩(wěn)定結(jié)果出現(xiàn)的時間和溫度，當(dāng)不穩(wěn)定點出現(xiàn)后，其之后的時間溫度觀測點隨之取消。但即使一直穩(wěn)定，本測定的觀測周期也僅為30 d時長。匯總穩(wěn)定性結(jié)果，填寫各自時間溫度穩(wěn)定性結(jié)果報告單。穩(wěn)定用“○”表示，不穩(wěn)定用“×”表示。經(jīng)檢驗，A、B型樣品均可在4℃及室溫(RT)條件穩(wěn)定存在30 d。結(jié)果可參見表1。

注：1-3為A型樣品，4、5為標(biāo)準(zhǔn)A、B型，6-8為B型樣品。圖1 酯酶-1的均勻性檢驗結(jié)果 Note. 1-3 are samples of type A. 4 and 5 stand for the standard of type A and B. 6-8 are samples of type BFig.1 Results of the esterase-1 homogeneity test

溫度/T1d3d7d14d30d4℃○○○○○RT○○○○○

注：“○”表示樣品穩(wěn)定。

Note.“○”indicates that the sample is stable.

1.3.2 凍融穩(wěn)定性檢驗

分別抽取兩個型別的樣品各3管，加50 μL抽取蒸餾水還原。充分溶解混勻后，放入-20℃冰箱中冷凍2 h。置于室溫融化后點樣(點樣后繼續(xù)冷凍2 h)，按照GB/T14927.1-2008對樣品進(jìn)行檢測，觀測凍融1次的穩(wěn)定性結(jié)果。如出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)型不符，即判定為凍融不穩(wěn)定，終止實驗。如穩(wěn)定則按照上述方法進(jìn)行第2次和第3次凍融穩(wěn)定性監(jiān)測。經(jīng)檢驗，凍融三次a、b型酯酶-1樣品均能穩(wěn)定存在。所制樣品的凍融穩(wěn)定性良好。

1.4 參加實驗室

全國共11家實驗室報名參加本次能力驗證計劃， 11家實驗室反饋結(jié)果。其中，省級實驗動物質(zhì)檢系統(tǒng)實驗室7家(含國家質(zhì)檢中心)，省級疾病預(yù)防控制中心實驗室2家，科研院所2家；在地域分布上，涵蓋了北京、上海、黑龍江、吉林、遼寧、新疆、四川、陜西、湖北、廣東和廣西。

1.5 樣品的編號和發(fā)放

能力驗證樣品為小鼠血清凍干樣品，每份3管，每管裝量50 mg/管，性狀為白色固體。由中國食品藥品檢定研究院加工并經(jīng)過均勻性和穩(wěn)定性檢驗，采取隨機編號的原則抽樣發(fā)放，全程冷鏈運輸。

1.6 檢測項目和要求

檢測項目為小鼠血清中的酯酶-1a基因型和b基因型。結(jié)果判讀可參見國標(biāo)GB/T 14927.1-2008。檢測方法選擇推薦但不局限與國標(biāo)方法。參與者需登錄網(wǎng)上報名系統(tǒng)進(jìn)行報名、樣品確認(rèn)、下載作業(yè)指導(dǎo)書及上報結(jié)果。原始記錄需在規(guī)定時間內(nèi)寄回。

1.7 結(jié)果評價

本次能力驗證的結(jié)果是一個定性的結(jié)果。依據(jù)GB/T14927.1-2008，對各實驗室提供的原始記錄和檢測結(jié)果進(jìn)行判定。如參加的實驗室提供的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果完全一致，則參加者結(jié)果為滿意結(jié)果；如實驗室提供的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，則為不滿意結(jié)果。另，未按時限反饋結(jié)果、不能提供實驗記錄中原始圖片或其掃描件的參加者,結(jié)果為不滿意。

2 結(jié)果

11家參與項目的單位中，獲滿意結(jié)果的實驗室10家，占參加單位的90.9%；不滿意結(jié)果有1家，占參加單位的9.1%。詳見表2。

表2 能力驗證酯酶-1結(jié)果一覽表

注：*表示不滿意結(jié)果。

Note.*means an unsatisfactory result.

3 討論與建議

3.1 方法的選擇

作業(yè)指導(dǎo)書中詳細(xì)描述了樣品在測試前需要加入蒸餾水50μL溶解樣品。未限制測定方法，推薦使用GB/T14927.1-2008實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測方法，參加本次能力驗證的實驗室集中采用了國標(biāo)方法。

3.2 不滿意結(jié)果原因分析

判定為不滿意結(jié)果的實驗室有1家：代碼為333的實驗室將樣品CBG0090013的酯酶-1判斷為a型，而標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果是b型。該實驗室提供的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，判定為不滿意結(jié)果。代碼為333的實驗室提供的原始結(jié)果圖，條帶可見，但條帶區(qū)分度較差，分析可能為電泳時間不夠，或者電泳基質(zhì)、緩沖液存在問題，使得電泳后的條帶區(qū)分不明顯，A、B帶型判斷有誤。

另，代碼為333的實驗室提供的圖片上只有條帶截圖，不能看到點樣原點及電泳方向標(biāo)識，這對于不滿意結(jié)果分析是一個不利因素(見圖2)。

圖2 代碼333實驗室的原始記錄Fig.2 Original records of Laboratory No. 333

3.3 發(fā)現(xiàn)的問題

3.3.1 適用標(biāo)準(zhǔn)沒有及時更新

本次能力驗證具體實驗方法的參考依據(jù)為國家標(biāo)準(zhǔn)的GB/T14927.1-2008，遺傳質(zhì)量控制參考總原則為GB14923-2010。有3家實驗室引用了質(zhì)控總則沒有更新，仍為GB14923-2001，或者寫為GB/T14923-2001，或者GB14923-2011。(如圖3～圖5所示)

圖3 代碼562實驗室的原始記錄Fig.3 Original record of Laboratory No.562

圖4 代碼634實驗室的原始記錄Fig.4 Original record of Laboratory No. 634

圖5 代碼259實驗室的原始記錄Fig.5 Original record of Laboratory No.259

3.3.2 打印錯誤或者上報錯誤

本次能力驗證計劃中，有1家實驗室將檢驗依據(jù)GB/T 14927.1-2008打成了GB/T 4927.1-2008(圖6)。另有代碼為562的實驗室原始記錄及報告均為正確結(jié)果，但在網(wǎng)絡(luò)上報系統(tǒng)中填寫結(jié)果時，將CBG0090021的a型誤填為b型。

圖6 代碼634實驗室的原始記錄Fig.6 Original record of Laboratory No. 634

3.3.3 原始記錄樣品內(nèi)容與實際不一致

實際樣品為小鼠血清凍干樣品，并非實驗小鼠，代碼259的實驗室在樣品定義上不夠嚴(yán)謹(jǐn)(見圖7)。

圖7 代碼259實驗室的原始記錄Fig.7 Original record of Laboratory No. 259

3.4 細(xì)節(jié)規(guī)范還需注意

多數(shù)實驗室在多次參加能力驗證的基礎(chǔ)上總結(jié)經(jīng)驗，避免了往年如無中生有的錯誤，并且如代碼049的實驗室原始記錄在樣品的前后處理都做了詳細(xì)說明，代碼為620的實驗室進(jìn)行了樣品的復(fù)檢，這些都值得我們借鑒。但是除了標(biāo)準(zhǔn)適用的集中問題之外，如書寫錯誤等小問題仍需多加注意。代碼259的實驗室上報結(jié)果為AA、BB等帶型，雖然結(jié)果也可以視為正確，但是在作業(yè)指導(dǎo)書中明確寫著結(jié)果上報為a、b型，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步注意規(guī)范。

3.5 實驗室質(zhì)量控制建設(shè)需不斷加強

能力驗證活動的實質(zhì)是提高實驗室的質(zhì)量管理水平和質(zhì)量控制能力，為數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、可靠提供外部的質(zhì)量保證活動。組織單位需要做好組織和宣傳工作，參加單位應(yīng)當(dāng)做好足夠的準(zhǔn)備，以便項目能夠順利實施，增進(jìn)實驗室間的交流學(xué)習(xí)，發(fā)現(xiàn)問題，提升各自的檢測水平。

從結(jié)果反饋來看，多數(shù)實驗室在多次參加能力驗證的基礎(chǔ)上總結(jié)經(jīng)驗有了很大提高，但是在細(xì)節(jié)及管理管理規(guī)范上仍有待加強。需要加強實驗體系的管理及標(biāo)準(zhǔn)的宣貫，充分利用參加能力驗證的機會檢驗所有相關(guān)環(huán)節(jié)的質(zhì)量活動，發(fā)現(xiàn)問題及時整改，從而使質(zhì)量體系得到完善。

[1] 孫虎山，王宜艷，王慧麗. 櫛孔扇貝血淋巴中酯酶活性及其性質(zhì)[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2006,13(1): 39-44.

[2] 盧黎. 威寧雞與貴州黃雞血清酯酶-1的多態(tài)性比較研究[J]. 貴州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2012, 29(5): 46-48.

[3] 李愛華，張慧茹，侯玲.灘羊血清酯酶-1同工酶與肌肉脂肪酸含量的研究[J]. 黑龍家畜牧獸醫(yī), 2005, 7: 22-23.

[4] GB/T 14927.1-2008. 實驗動物近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測法[S].

[5] 席靜，張思群，劉靜宇，等．論能力驗證活動對實驗室能力建設(shè)的作用和意義[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2011, 21(6): 1576-1578．

[6] 王洪，魏杰，李芳芳，等．實驗動物質(zhì)檢機構(gòu)堿性磷酸酶-1測定能力驗證評價[J]. 中國藥事, 2014, 28(12): 1339-1341．

[7] 魏杰，王洪，鞏薇，等．實驗小鼠腎勻漿中酯酶-3的實驗室測定能力驗證結(jié)果評價[J].中國實驗動物學(xué)報, 2016, 24(2): 204-207．

[8] 王洪，魏杰，于鵬麗，等．實驗小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1實驗室檢測能力驗證結(jié)果評價[J].中國實驗動物學(xué)報, 2016, 24(2): 199-203．

Evaluation report of the proficiency testing of serum esterase-1 in laboratory mice

WEI Jie, WANG Hong, GONG Wei, YU Peng-li, YUE Bing-fei*

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To strengthen the quality control management and enhance the detection capacity of the experimental animal quality control laboratoriesin our country through the detection of serum esterase-1 (Es-1) in the experimental mice. Methods The samples were prepared according to the standard procedure, and then were randomly numbered and distributed to participating units by cold-chain transport. Before the deadline, the participants submitted the results and the copies of original records. When the results were completely consistent with the standard results,the results were regarded as satisfactory, otherwise were unsatisfactory. Results A total of 11 laboratories participated in this program, of which 10 laboratories were regarded as satisfactory (90.9%) and one laboratory obtained unsatisfactory result (9.1%). Conclusions The results of this proficiency testing project demonstrate that the overall detection level of Es-1 in laboratory mice is highof the participating laboratories. However, more attention still should be paid to standard specifications and some test details.

Proficiency testing; Quality control; Esterase-1

魏杰(1982-)，女，碩士，助理研究員。研究方向：免疫遺傳檢測。E-mail：jane3040320@163.com

岳秉飛(1960-)，男，博士，研究員。研究方向：動物遺傳學(xué)。E-mail：y6784@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0063-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.012

2016-08-25