RNA干擾誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因表達(dá)對(duì)人膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

彭思遠(yuǎn)，呂品，謝博文，劉蘇來(lái)，蔣波

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

膽管癌是最常見的膽道惡性腫瘤之一，約占人類消化道惡性腫瘤總病例的3%[1]。中國(guó)膽管癌患者人數(shù)眾多，在全世界膽管癌患者總數(shù)中所占比例約為55%[2]，因此在我國(guó)研究膽管癌具有特殊的條件和意義。近年來(lái)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）被報(bào)道在多種腫瘤組織中存在高表達(dá)[3-5]。iNOS的上調(diào)表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)，并可預(yù)測(cè)不良預(yù)后[6]。筆者[7]前期研究發(fā)現(xiàn)iNOS在膽管癌細(xì)胞中存在高表達(dá)，且與膽管癌的發(fā)展呈正相關(guān)，但其在膽管癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)化學(xué)合成iNOS-siRNA沉默iNOS基因，檢測(cè)膽管癌細(xì)胞增殖能力以及凋亡情況的變化，從而探討iNOS在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為膽管癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人膽管癌細(xì)胞株QBC939 由湖南省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所保存。β-actin一抗、羊抗兔二抗、RIPA蛋白裂解液及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天公司。iNOS抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司。MTT、DMSO及Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。免疫組化試劑盒購(gòu)自博士德公司。RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司。PrimeScript?RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript?RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。Annexin V Apoptosis Detection Kit APC流式凋亡試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 針對(duì)iNOS設(shè)計(jì)合成特異性siRNA序列設(shè)計(jì)合成的序列分別為siRNA1：CCA TCC GCT CCA CAC TAA A；siRNA2：CAG TGG AAT GAG TCC TTT A；siRNA3：AGA CGT CTT TGG AAT CCA A； 陰 性 siRNA：GCT GGT TAT TGC TAA CAT A。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組（siRNA1、siRNA2、siRNA3）。空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)的QBC939細(xì)胞。陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染陰性siRNA的QBC939細(xì)胞。iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染iNOS-siRNA的QBC939細(xì)胞。用1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素溶液培養(yǎng)，5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)QBC39細(xì)胞，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QBC939細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染在六孔板中進(jìn)行，細(xì)胞鋪滿70%～90%，轉(zhuǎn)染前4 h換新培養(yǎng)基。將混在一起的siRNA-Lipofectamine 2000混合液體均勻加入六孔板中。輕輕晃動(dòng)六孔板，使其均勻分布，然后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率最高時(shí)，篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組QBC939細(xì)胞中mRNA的表達(dá) iNOS基因的上游引物序列為5'-GGA GCC AGC TCT GCA TTA TC-3'，下游引物序列為5'-ACT CCA TGC CCA GGA AGG AAG G-3'；內(nèi)參基因β-actin的上游引物序列為5'-GAG AGA TGA CCC AGA TCA TGT-3'，下游引物序列為5'-TTT TGT CTC CAA GGG ACC AG-3'。收集iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞，以O(shè)mega RNA提取試劑盒提取各細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變形15 s，60 ℃退火 60 s，70 ℃延伸 40 s，共 40個(gè)循環(huán)。取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的基因和內(nèi)參基因條帶的灰度比值作為iNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組QBC939細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá) 收集iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞，提取20 μL細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。用5%的BSA封閉液封閉1 h后，加iNOS抗體（1:1 000）4 ℃過(guò)夜，二抗（羊抗兔IgG）室溫孵育1 h，BeyoECL Western熒光檢測(cè)試劑檢測(cè)蛋白，X光曝光顯影。根據(jù)條帶灰度值計(jì)算iNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)消化重懸后用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 000/孔，接種于96孔板，分別處理培養(yǎng)0、12、24、36、60 h用于檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后開始實(shí)驗(yàn)，各組每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)取3孔，吸除培養(yǎng)液，加入MTT液15 μL，放入培養(yǎng)箱中孵化。吸除MTT液，加入DMSO 150 μL振蕩10 min后，在96孔酶標(biāo)儀上讀取OD值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組QBC939細(xì)胞的周期 收集iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞，以70%乙醇預(yù)冷，4 ℃過(guò)夜固定，1 000 r/min離心5 min后沉淀細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞后再次離心并沉淀細(xì)胞。加入碘化丙啶（PI）染色液，37 ℃避光溫浴30 min，適當(dāng)添加1～1.5 mL染色液重懸使細(xì)胞通過(guò)率達(dá)到200～350細(xì)胞/s，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期所占比例。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組QBC939細(xì)胞的凋亡 收集iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞，PBS重懸并計(jì)數(shù)，取5～10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-APC結(jié)合液重懸細(xì)胞沉淀。加入5 μL Annexin V-APC，混勻后4 ℃避光孵育15 min，再加入5 μL PI染色液，混勻后4 ℃避光孵育5 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用Oneway ANOV法分析各組差異，若方差齊性，則采取LSD法進(jìn)行分析；方差不齊，則采取t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效果鑒定

合成的siRNA經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000導(dǎo)入人膽管癌QBC939細(xì)胞，在顯微鏡下，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可見有綠色熒光表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞則不會(huì)見到熒光（圖1）。通過(guò)計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率都在70%以上，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 各組細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)情況（×200）Figure 1 Green fluorescence expressions of each group of cells (×200)

2.2 iNOS干擾效果分析

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞中iNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.46±0.02、0.20±0.04、0.56±0.05；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞中iNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.13、1.00±0.15；轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞中iNOS mRNA的表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞中iNOS mRNA的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞中iNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.60±0.07、0.48±0.07、1.07±0.10，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞中iNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.42±0.11、1.43±0.14；轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05），陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

轉(zhuǎn)染組中siRNA2對(duì)QBC939細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后iNOS基因沉默效果最佳，將選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 各組細(xì)胞iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)水平Figure 2 Relative level of iNOS mRNA expression in each group of cells

圖3 各組細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)Figure 3 The iNOS protein expression in each group of cells

2.3 iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05）；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況Figure 4 Proliferation status in each group of cells

2.4 iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)QBC939細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞的比例分別為（82.39±3.43）%、（60.61±3.23）%、（59.35±3.11）%，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞的比例明顯多于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞中S期和G2/M期細(xì)胞的比例則明顯少于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞的增值指數(shù)分別為17.61±1.29、39.39±1.26和40.65±1.71，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞的增值指數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)QBC939細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組QBC939細(xì)胞的凋亡率分別為（30.39±5.83）%、（12.51±1.82）%、（6.21±2.13）%，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞的凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（均P＜0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖6）。

圖5 各組細(xì)胞周期檢測(cè)情況Figure 5 Cell-cycle analysis of each group of cells

圖6 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)情況Figure 6 Apoptosis analysis of each group of cells

3 討 論

近年來(lái)，膽管癌的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，在消化道惡性腫瘤中是遞增速度最快的[8]。因其較為特殊的病理特點(diǎn)和解剖特點(diǎn)，人們對(duì)膽管癌的診斷和治療尚未取得突破性進(jìn)展。手術(shù)治療仍然是當(dāng)前的首選治療方式。但膽管癌惡性程度高、預(yù)后極差，術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高[9]。研究者們開始不斷探索新的有效的膽管癌治療途徑。隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療已經(jīng)成為抗腫瘤研究的一大熱點(diǎn)[10]。目前，已有數(shù)種膽管癌靶向治療藥物被批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)，包括EGFR抑制劑（如西妥昔單抗、埃羅替尼和吉非替尼）、Raf激酶抑制劑（如索拉非尼）、HER-2抑制劑（如曲妥珠單抗、拉帕替尼），還有血管內(nèi)皮因子抑制劑（如索拉非尼、貝伐單抗）[11]。相關(guān)研究[12]顯示，應(yīng)用吉西他濱+奧沙利鉑聯(lián)合埃羅替尼治療膽管癌，患者擁有5.9個(gè)月的平均進(jìn)展期生存時(shí)間，而不聯(lián)合埃羅替尼的患者為3個(gè)月。當(dāng)然，這些靶向藥物的臨床療效還有待于進(jìn)一步證實(shí)。綜上所述，我們迫切希望利用RNA干擾技術(shù)尋找膽管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵性的靶向基因，從而為膽管癌的臨床治療開辟新的道路。

iNOS代表誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，人iNOS基因定位在17cen-q11.2[13]，基因全長(zhǎng)37Kb，由26個(gè)外顯子組成。iNOS通常在炎癥、腫瘤等病理情況下由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，然后誘導(dǎo)合成大量NO[14]，后者被很多學(xué)者認(rèn)為是一類致癌分子。其一，NO可通過(guò)介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）促進(jìn)新生血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]；其二，NO在DNA損傷、癌基因活化、抑制DNA修復(fù)酶活性、抑制抑癌基因表達(dá)、致細(xì)胞凋亡以及促細(xì)胞惡變等許多方面起著重要作用[16-17]。iNOS與腫瘤有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，在許多腫瘤中都有著較高的表達(dá)。例如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等，都有關(guān)于iNOS表達(dá)增高的研究[5,18-19]。同時(shí)，有研究[20-21]表明，iNOS在胃癌、鼻咽癌、惡性淋巴瘤以及骨肉瘤等惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用。還有報(bào)道，在婦科腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌以及黑素瘤等多種疾病中，腫瘤的惡性程度跟iNOS升高程度呈正相關(guān)[22]。另一方面，在結(jié)腸癌和乳腺癌的臨床前研究發(fā)現(xiàn)，抑制iNOS的表達(dá)能夠有效預(yù)防腫瘤進(jìn)展[23]。目前，國(guó)際上iNOS基因在膽管癌中的研究報(bào)道并不多，在膽管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，iNOS基因是否同樣發(fā)揮了重要作用，有待于我們進(jìn)行新的研究。

有研究者[24]設(shè)計(jì)并構(gòu)建了靶向survivin基因的shRNA載體，將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有絲分裂明顯發(fā)生障礙，凋亡明顯增加，并且腫瘤血管的生成也受到了抑制。還有研究者[25]對(duì)肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行研究，將其轉(zhuǎn)染livin與survivin的shRNA載體，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染組對(duì)癌細(xì)胞的抑生長(zhǎng)和促凋亡作用明顯優(yōu)于對(duì)照組和單轉(zhuǎn)染組。本研究將化學(xué)合成的iNOS-siRNA成功轉(zhuǎn)染人膽管癌QBC939細(xì)胞，結(jié)果顯示，iNOS基因沉默能成功抑制iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)；iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，提示沉默iNOS基因表達(dá)后，膽管癌細(xì)胞增殖速度受到了抑制；同時(shí)，iNOS-siRNA轉(zhuǎn)染組QBC939細(xì)胞的凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，說(shuō)明沉默iNOS誘導(dǎo)了膽管癌細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果為膽管癌的基因治療提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

總之，通過(guò)RNA干擾沉默iNOS基因可明顯抑制人膽管癌QBC939細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見，iNOS基因是膽管癌發(fā)生、發(fā)展的促進(jìn)因素，它可能成為膽管癌治療的潛在靶點(diǎn)。受條件所限，本研究?jī)H針對(duì)膽管癌細(xì)胞中單獨(dú)的基因iNOS進(jìn)行了沉默，并處體外實(shí)驗(yàn)階段。關(guān)于iNOS基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)作用的具體分子機(jī)制，還有許多研究工作需要深入開展。相信在不久的將來(lái)靶向基因治療將成為膽管癌治療的主攻方向，iNOS基因或?qū)⒊蔀槟懝馨┗蛑委煹年P(guān)鍵分子靶點(diǎn)。

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