適于益生菌發(fā)酵的青稞酶解液制備工藝優(yōu)化

萬 萍易曉成 鄧 娟 黃麗華

(1. 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2. 四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830)

適于益生菌發(fā)酵的青稞酶解液制備工藝優(yōu)化

萬 萍1易曉成2鄧 娟1黃麗華1

(1. 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2. 四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830)

采用程序升溫法對(duì)青稞進(jìn)行酶解，以還原糖含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對(duì)青稞酶解液制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：按料水比1∶15(g/mL)溶解青稞粉，經(jīng)糊化后冷卻至45 ℃，加入8.9 U/g·青稞的α-淀粉酶和原料質(zhì)量2.0%，3.5%的糖化酶、菠蘿蛋白酶，保溫20 min后升溫到60 ℃酶解，直至碘試液體呈無色，過濾得到青稞酶解液，其還原糖、氨基酸態(tài)氮含量分別為5.68%、0.47 g/L，可作為制備益生菌發(fā)酵青稞飲料的良好基質(zhì)。

青稞；酶解液；還原糖；程序升溫法；益生菌發(fā)酵液

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)屬于禾本科植物，主要產(chǎn)自中國(guó)的青藏高原，青藏高原也是世界上最早(公元前1100年)栽培青稞的地區(qū)[1]。青稞僅含少量的脂和糖，卻含有較高的蛋白質(zhì)、纖維素以及維生素等，其中蛋白質(zhì)含量平均可達(dá)11.31%、脂肪1.80%～3.09%、淀粉含量 70%以上[2]，除含有包括8種人體必需氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸外，還含有12種微量元素如鈣、鎂、硒、銅、鋅、鉻、錳、鐵、磷等[3]，其β-葡聚糖含量在3.66%～8.62%，平均值為5.25%?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)[2]已經(jīng)證明青稞不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且在降血脂、預(yù)防糖尿病、促進(jìn)胃動(dòng)力等方面具有獨(dú)特的保健作用。青稞既可以作為糧食，也可用于加工各類食品，如餅干、蛋糕、麥片粥、米花、青稞酒、青稞汁飲料等。

研究證明益生菌對(duì)腸道功能紊亂、呼吸感染以及過敏性癥狀有治療作用[4]，同時(shí)具有調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)、提高乳糖的利用率、防癌、降低膽固醇等功能[5]。國(guó)外研究者如Martensson等[6]的研究證明了：在燕麥這樣的非乳基質(zhì)上益生菌能很好地存活和生長(zhǎng)，并在冷藏條件下存活率較高。益生菌是定殖于宿主腸道內(nèi)、當(dāng)達(dá)到一定量就能對(duì)宿主產(chǎn)生積極作用的一類活菌。利用青稞淀粉生產(chǎn)益生菌發(fā)酵食品，是青稞產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)新發(fā)展的一條新途徑。益生菌不能直接利用青稞淀粉進(jìn)行發(fā)酵，在生產(chǎn)益生菌發(fā)酵青稞飲料時(shí)，首先要將青稞淀粉進(jìn)行酶解糖化，以提供能被益生菌利用的還原糖類[7]。同時(shí)，如果能先將結(jié)合于淀粉顆粒上的蛋白質(zhì)降解，生成一定量的氨基酸，使酶解液有更適宜的碳氮比，則更有利于淀粉酶解，進(jìn)而有效地增進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)。

本研究擬利用由α-淀粉酶、糖化酶、菠蘿蛋白酶組成的復(fù)合酶的協(xié)同作用，采用程序升溫法對(duì)青稞進(jìn)行酶解。采用程序升溫是基于45 ℃為菠蘿蛋白酶最適作用溫度，而60 ℃則為兼顧α-淀粉酶和糖化酶的最適作用溫度，可使液化和糖化同時(shí)進(jìn)行，在產(chǎn)生足夠還原糖的同時(shí)確保淀粉最大限度水解成可溶性低聚糊精和低聚糖，以構(gòu)成益生菌發(fā)酵所需的益生元；研究不同料水比、α-淀粉酶用量、糖化酶用量和菠蘿蛋白酶用量對(duì)青稞酶解液還原糖含量的影響；并以還原糖含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對(duì)青稞酶解液制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期制備出能適合益生菌發(fā)酵的青稞酶解液，并為益生菌發(fā)酵青稞飲料的進(jìn)一步工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

中溫α-淀粉酶：≥3 700 U/g，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

糖化酶(固體型10萬U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬U/g)：銳陽(yáng)生物科技有限公司；

檸檬酸：食品級(jí)，市售。

1.1.2 儀器

高速萬能粉碎機(jī)：FW-100型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

水浴振蕩器：HZS-H型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

電子天平：LD型，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；

電熱恒溫干燥箱：DHG-9141型，上海宏精實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

分析天平：BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

青稞→粉碎、過篩→加水混勻→加熱糊化→冷卻→調(diào)節(jié)pH→加入α-淀粉酶、糖化酶、菠蘿蛋白酶→攪拌均勻→保溫酶解→滅酶→過濾→青稞酶解液

1.2.2 理化指標(biāo)檢驗(yàn)方法

(1) 還原糖的測(cè)定：直接滴定法[8]138-140，以葡萄糖計(jì)。

(2) 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：電位滴定法[8]198。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取影響青稞酶解的關(guān)鍵因素：料水比、α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠蘿蛋白酶用量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以還原糖含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面法對(duì)益生菌發(fā)酵青稞飲料酶解液制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果為每組2個(gè)平行樣的平均值。

(1) 料水比對(duì)還原糖含量的影響：準(zhǔn)確稱取10份過80目篩的青稞粉，每份5 g，盛于10個(gè)250 mL的三角瓶中，分為5組，每組2份做平行樣，分別按料水比1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶17.5，1∶20(g/mL)加入35 ℃的水，攪拌使其充分吸水，糊化20 min后冷卻至50 ℃左右，用10%的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至5.0左右，然后分別加入原料質(zhì)量的8 U/g的α-淀粉酶，1.9%的糖化酶和3.5%的菠蘿蛋白酶，放入水浴震蕩器中45 ℃保溫20 min，繼續(xù)升溫至60 ℃酶解直至碘試液體呈無色，然后在沸水浴中滅酶10 min后進(jìn)行過濾，得到青稞酶解液，測(cè)定其還原糖含量，確定最適料水比。

(2)α-淀粉酶用量對(duì)還原糖含量的影響：按1.2.3(1)確定的最適料水比溶解青稞粉，除加入青稞質(zhì)量1.9%的糖化酶和3.5%的菠蘿蛋白酶外，分別按4，6，8，10，12 U/g·青稞的比例加入α-淀粉酶，其它同1.2.3(1)，測(cè)定其還原糖含量，以確定最適α-淀粉酶用量。

(3) 糖化酶用量對(duì)還原糖含量的影響：按1.2.3(1)確定的最適料水比溶解青稞粉，除加入8 U/g·青稞的α-淀粉酶和3.5%的菠蘿蛋白酶外，分別加入青稞質(zhì)量的1.3%，1.6%，1.9%，2.2%，2.5%的糖化酶，其它同1.2.3(1)，測(cè)定其還原糖含量，以確定最適的糖化酶用量。

(4) 菠蘿蛋白酶用量對(duì)還原糖和氨基酸態(tài)氮含量的影響：按1.2.3(1)確定的最適料水比溶解青稞粉，除加入8 U/g·青稞的α-淀粉酶和1.9%的糖化酶外，每組分別加入青稞質(zhì)量2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%的菠蘿蛋白酶，其它同1.2.3(1)，測(cè)定還原糖和氨基酸態(tài)氮的含量，以確定最適菠蘿蛋白酶用量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料水比對(duì)還原糖含量的影響 水是物料和酶的溶劑，生化酶促反應(yīng)都須在水中進(jìn)行，料水比影響酶促反應(yīng)底物濃度進(jìn)而影響青稞中蛋白質(zhì)和淀粉的酶解，以及最終制得的酶解液中還原糖和氨基酸態(tài)氮的含量。本研究考察了料水比對(duì)青稞酶解液中還原糖含量的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，酶解液中的還原糖含量隨料水比的增加而減少。還原糖含量直接影響益生菌的生長(zhǎng)以及發(fā)酵后產(chǎn)品的酸度，在一定范圍內(nèi)還原糖含量越高經(jīng)發(fā)酵后生成的酸也越多，酸度也就越高，反之亦然。酸度過高影響口感和穩(wěn)定性，過低又達(dá)不到要求；通?？赏ㄟ^料水比控制酶解液中還原糖含量以達(dá)到設(shè)計(jì)產(chǎn)品的要求。在料水比為1∶15(g/mL)時(shí)，還原糖含量為5.54%，能符合設(shè)計(jì)產(chǎn)品的要求，因此，確定最適料水比為1∶15(g/mL)。

2.1.2α-淀粉酶用量對(duì)還原糖含量的影響α-淀粉酶又稱液化酶，作用于淀粉后其主要產(chǎn)物是糊精，糊精在α-淀粉酶和糖化酶的協(xié)同作用下生成還原糖和少量低聚糖[9]。本研究考察了α-淀粉酶用量對(duì)還原糖含量的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)α-淀粉酶用量小于8 U/g·青稞時(shí)，還原糖含量隨α-淀粉酶用量的增加呈上升趨勢(shì)；α-淀粉酶的用量為8 U/g·青稞時(shí)，還原糖含量達(dá)到了最高值(5.57%)；α-淀粉酶用量高于8 U/g·青稞后，還原糖含量隨著α-淀粉酶用量的增加趨于穩(wěn)定且略有下降，說明α-淀粉酶用量過多會(huì)抑制其酶活。所以，確定α-淀粉酶的最適用量為8 U/g·青稞。

2.1.3 糖化酶用量對(duì)還原糖含量的影響 糖化酶可使淀粉的α-1，4-和α-1，6-糖苷鍵水解而生成葡萄糖，同時(shí)還能水解糊精、糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖[10]。本研究考察了糖化酶用量對(duì)還原糖含量的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)糖化酶用量小于1.9%時(shí)，還原糖含量隨糖化酶用量的增加呈上升趨勢(shì)；糖化酶用量為1.9%時(shí)，還原糖含量達(dá)到了最大值(5.59%)；糖化酶用量高于1.9%后，隨著糖化酶用量的增加，其還原糖含量趨于穩(wěn)定。所以，確定糖化酶的最適用量為1.9%。

2.1.4 菠蘿蛋白酶用量對(duì)還原糖和氨基酸態(tài)氮含量的影響

青稞中含有淀粉顆粒結(jié)合蛋白，利用菠蘿蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸，不僅為酶解液提供了菌體生長(zhǎng)所需的速效氮源，同時(shí)也有利于淀粉的酶解，提高酶解液中還原糖含量，使酶解液含有適宜的碳源和氮源，更有利于益生菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵，并提高益生菌青稞發(fā)酵飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]。本研究考察了菠蘿蛋白酶用量對(duì)還原糖和氨基酸態(tài)氮含量的影響，其結(jié)果見圖4。

由圖4可知，菠蘿蛋白酶可以明顯提高酶解液中氨基酸態(tài)氮和還原糖的含量，當(dāng)菠蘿蛋白酶用量小于3.0%時(shí)，隨著酶用量的增加，氨基酸態(tài)氮和還原糖含量均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)；當(dāng)菠蘿蛋白酶用量為3.0%時(shí)，氨基酸態(tài)氮和還原糖的含量均達(dá)到最高值，分別為0.45 g/L和5.65%；當(dāng)菠蘿蛋白酶用量大于3.0%時(shí)，隨著酶用量的增加，還原糖含量趨于穩(wěn)定，而氨基酸態(tài)氮含量則略有降低。因此，最適菠蘿蛋白酶用量確定為3.0%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 依據(jù)Box-Behken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，以α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠蘿蛋白酶用量3個(gè)因素為自變量，以還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)組[11-12]，試驗(yàn)因素水平見表1。

根據(jù)試驗(yàn)因素和水平的相關(guān)要求，設(shè)計(jì)了17 次試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果見表 2。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 應(yīng)用Design-Expert 8.0.5.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到α-淀粉酶用量A、糖化酶用量B、菠蘿蛋白酶用量C3個(gè)因素與還原糖百分含量Y之間的多元二次回歸方程為：

Y=5.65+0.031A+0.040B+0.036C+0.015AB-0.012AC-0.015BC-0.029A2-0.037B2-0.004 25C2。

(1)

表3為Design-Expert 8.0.5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析得出的多元二次回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果。

運(yùn)用Design-Expert 8.0.5.0 軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出二次回歸方程的響應(yīng)面及等高線圖見圖5～7。

由圖5可知，α-淀粉酶用量和糖化酶用量對(duì)還原糖含量均有較大影響，且糖化酶用量對(duì)還原糖含量的影響大于α-淀粉酶用量的影響；等高線圖橢圓度較大，說明α-淀粉酶用量和糖化酶用量?jī)梢蛩亻g交互作用顯著。

由圖6可知，菠蘿蛋白酶用量對(duì)還原糖含量的影響大于α-淀粉酶用量的影響；等高線圖橢圓度較大，說明α-淀粉酶用量與菠蘿蛋白酶用量?jī)梢蛩亻g交互作用顯著。

由圖 7 可知，糖化酶用量和菠蘿蛋白酶用量對(duì)還原糖含量均有較大影響，且糖化酶用量對(duì)還原糖含量的影響大于菠蘿蛋白酶用量的影響；等高線圖的橢圓度較大，說明糖化酶用量和菠蘿蛋白酶用量?jī)梢蛩亻g交互作用顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證

由Design-Expert 8.0.5.0軟件得到優(yōu)化后的青稞酶解液制備工藝，確定最佳工藝參數(shù)為：料水比1∶15(g/mL)，糖化酶用量2.03%，α-淀粉酶用量8.90 U/g·青稞，菠蘿蛋白酶用量3.50%，預(yù)測(cè)的還原糖含量為5.69%。根據(jù)最佳酶解工藝參數(shù)，考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，以料水比1∶15(g/mL)，糖化酶用量2.0%，α-淀粉酶用量8.9 U/g·青稞，菠蘿蛋白酶用量3.5%，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得值還原糖含量為5.68%，與理論值的相對(duì)誤差為0.17%；其氨基酸含量為0.47 g/L。采用響應(yīng)面法優(yōu)化法得到的青稞酶解液制備的最佳工藝條件與實(shí)際相符合。

3 結(jié)論

(1) 本研究采用程序升溫法對(duì)青稞進(jìn)行酶解，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)青稞酶解液制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠蘿蛋白酶用量3個(gè)因素對(duì)青稞酶解液的還原糖含量均有極顯著影響，3個(gè)因素兩兩間的交互作用對(duì)還原糖含量也有顯著影響。益生菌發(fā)酵青稞酶解液的最佳工藝條件為：按料水比1∶15(g/mL)溶解青稞粉，經(jīng)糊化后冷卻至45 ℃，加入8.9 U/g·青稞的α-淀粉酶和原料質(zhì)量2.0%，3.5%的糖化酶、菠蘿蛋白酶，保溫20 min后，再升溫到60 ℃保溫酶解直至碘試液體呈無色，過濾得到青稞酶解液，此條件下制備的青稞酶解液的還原糖、氨基酸態(tài)氮含量分別為5.68%、0.47 g/L。

(2) 本研究利用由α-淀粉酶、糖化酶、菠蘿蛋白酶組成的復(fù)合酶協(xié)同作用和程序升溫法對(duì)青稞進(jìn)行酶解，使所制得的酶解液中同時(shí)含有碳源、氮源和益生元，可作為制備益生菌發(fā)酵青稞飲料的良好基質(zhì)。

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Optimizationon preparation technology of highland barley enzymolysis liquid suitble for probiotic fermentation

WAN Ping1YIXiao-cheng2DENGJuan1HUANGLi-hua1

(1.CollegeofPharmacyandBiologicalEngineering,ChengduUniversity,Chengdu,Sichuan610106,China; 2.DepartmentofWineandFoodEngineeringSichuanTechnologyBusinessCollege,Dujiangyan,Sichuan611830,China)

The program warming method was applied to carry out the enzymatic hydrolysis of highland barley. The response surface methodology was used to optimize the enzymatic hydrolysis process of probiotic fermented barley with the reducing sugar content as the response value. The result indicated that the optimal conditions could be gotten: with the ratio of solid to liquid 1∶15(g/mL) to dissolve highland barley powder, pasting and cooling to 45 ℃, addition of 8.9 U/gα-amylase, 2.0% glucoamylase, 3.5% bromelain, incubating for 20 min and then heating to 60 ℃, incubating for saccharification to the iodine test showing colorless, getting highland barley enzyme saccharification liquid by filtration. Under the condtion, the content of reducing sugar was up to 5.68% and the content of amino acid nitrogen was 0.47 g/L, which could be used to produce probiotic fermented highland barley beverage.

highland barley; enzymatic hydrolysate; reducingsugar; program warming method; probiotic fermentation liquid

四川省教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào)：12ZA205)

萬萍，女，成都大學(xué)副教授。

易曉成(1962—)，男，四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師。 E-mail:562248038@qq.com

2016-12-22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.036