環(huán)境微生物DNA提取方法研究進(jìn)展

陽 靜張 靜 鄒 偉 趙興秀 趙長青

(1. 四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000；2. 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000)

環(huán)境微生物DNA提取方法研究進(jìn)展

陽 靜1,2張 靜1,2鄒 偉1,2趙興秀1,2趙長青1,2

(1. 四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000；2. 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000)

環(huán)境微生物DNA提取是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究微生物群落的基礎(chǔ)，DNA提取的純度及其結(jié)構(gòu)完整性直接影響后續(xù)試驗結(jié)果。環(huán)境樣品多種多樣，包括水樣、土壤、活性污泥、傳統(tǒng)發(fā)酵食品、白酒釀造環(huán)境等，使得DNA的提取方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前DNA的提取方法有很多，大致可以分為直接提取法和間接提取法。直接提取法操作簡便，耗時短，而雜質(zhì)較多；間接提取法操作復(fù)雜，耗時長，但純度較高。文章在對比各種DNA提取方法的基礎(chǔ)上，重點介紹了白酒釀造環(huán)境中DNA的提取方法和大片段DNA的提取及其研究進(jìn)展。

DNA提??；白酒釀造；大片段DNA

從1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick發(fā)現(xiàn)了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)到現(xiàn)在，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對DNA的了解越來越多。而要想研究其性質(zhì)特點，從生物中提取DNA是一種重要的方式。目前，雖然從單一生物體內(nèi)提取DNA的方法逐漸成熟，但對于復(fù)雜的環(huán)境微生物來說同時提取多種微生物的DNA仍然是一個很大的挑戰(zhàn)，故選擇一種較好的提取方法尤為重要。判斷一個好的提取方法不僅僅是看其提取出來的DNA含量、純度以及分子大小，其提取出來的DNA能否充分反映該環(huán)境中微生物種群多樣性也是關(guān)鍵。本文在對比了各種微生物DNA提取方法的基礎(chǔ)上，重點介紹了白酒釀造環(huán)境中DNA的提取方法和大片段DNA的提取以及其研究進(jìn)展，旨在為白酒釀造環(huán)境及其他環(huán)境微生物的DNA提取方法作出較為系統(tǒng)的總結(jié)，為從白酒釀造環(huán)境或其他類似環(huán)境中提取DNA提供參考。

1 DNA常規(guī)提取方法

基因組DNA的提取方法一般分為兩類，即直接提取法和間接提取法。直接提取法，即利用各種物理與化學(xué)方法直接從環(huán)境樣品中裂解細(xì)胞，再從中提取DNA。Ogram等[1]曾運用直接法將環(huán)境中的微生物DNA抽提出來。直接法操作相對簡便，不需要分離細(xì)胞，提取出來的DNA也更具代表性。然而，直接法雖然產(chǎn)量較高，純度卻一般較低，因為在其提取DNA的過程中，也會將其中含有的抑制劑像腐殖酸、褐菌酸等一起提取出來，進(jìn)而干擾或抑制了后續(xù)操作。間接提取法又叫細(xì)胞抽提法[2]，即先將細(xì)胞從環(huán)境中分離出來再從中提取DNA。Torsvik等[3]報道了間接提取法。間接提取法提取出來的DNA雖然純度較高，然而操作較為復(fù)雜，并且提取出來的DNA分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于直接法提取出來的。故對于選擇直接法還是間接法提取DNA的關(guān)鍵在于預(yù)處理。

1.1 預(yù)處理

在某些環(huán)境(如土壤、活性污泥、海洋沉積物、大曲等)中，往往存在一系列雜質(zhì)，如腐殖酸[4]、褐菌素[5]和重金屬離子[6]等，而正是由于這些雜質(zhì)，在進(jìn)行環(huán)境微生物DNA提取時，對其產(chǎn)率與效率造成不同程度的抑制，因而預(yù)處理在DNA提取過程中尤為重要。此處以對腐殖酸的處理為例進(jìn)行詳細(xì)敘述。

腐殖酸擁有獨特的結(jié)構(gòu)，為極性化合物，可以抑制SDS、溶菌酶及蛋白酶K等的活性[7]。目前，去腐的方法有很多，常用的方法有硫酸鋁法、PVPP法、CTAB法、氯化銫密度梯度離心法、交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖凝膠過濾樹脂、離子交換和高效分子量排阻層析、電洗脫等方法[8]。氯化銫密度梯度離心法與其他方法相比較復(fù)雜、昂貴且費時[9]，因此一般不選用。有人也利用焦磷酸鈉(磷酸四鈉)[10]和磷酸五鈉(STPP)[11]與其發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而將其除去。席峰等[12]在經(jīng)過多種緩沖液進(jìn)行預(yù)處理比較后，得出了一種優(yōu)化后的脫腐緩沖液(100 mmol/L Tris，pH 10.0，100 mmol/L Na4P2O7100 mmol/L Na2EDTA，1.0% PVP，100 mmol/L NaCl，0.05% Triton X-100，4.0%脫脂奶粉)，此種緩沖液比傳統(tǒng)的TENP等緩沖液脫腐作用更好。此外，宋培勇等[13]利用芬頓試劑(即過氧化氫與亞鐵離子組成的混合溶液)在提取DNA過程中對土壤中的腐殖酸進(jìn)行脫腐處理，芬頓試劑具有一定脫腐能力，并且對DNA片段降解影響不大。

1.2 細(xì)胞裂解

DNA的提取效率與細(xì)胞的裂解效率呈正相關(guān)，因此有效裂解細(xì)胞的方法對DNA的提取尤為關(guān)鍵，同時也需要考慮到DNA片段是否在裂解細(xì)胞的過程中受損。細(xì)胞裂解的方法主要分為三類，即物理法、化學(xué)法與生物酶法。

1.2.1 物理法 物理法即利用外力破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使其內(nèi)容物溶出，主要有液氮凍融法、玻璃珠振蕩法、液氮研磨法、超聲振蕩法(ultrasonication)和微波熱休克法(microwave heating)等[14]。物理法由于操作較為劇烈，所以往往不容易得到大片段DNA[15]。超聲法是一種較為劇烈的裂解方法，其設(shè)備費用較低、速度快、操作較為簡單，且能有效提取DNA。但是其超聲的時間對DNA的提取效率有比較大的影響。萬晶晶等[16]發(fā)現(xiàn)功率為50 Hz的超聲波在27 s時有最大DNA提取效率。曲艷玲[17]對液氮凍融法和液氮研磨法提取活性污泥DNA進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)用液氮凍融法提取DNA腐殖酸等含量較低，蛋白質(zhì)去除得較徹底。呂新等[18]通過比較得出利用玻璃珠振蕩法提取出來的DNA量較多，但腐殖酸污染較嚴(yán)重。

1.2.2 化學(xué)法 化學(xué)法是利用一些化學(xué)試劑對細(xì)胞進(jìn)行破壁裂解。常用的方法有十二烷基硫酸鈉(SDS)法和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法或兩者的結(jié)合使用。SDS是一種陰離子表面活性劑，能與膜脂蛋白相互作用進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。而CTAB是一種陽離子去污劑，能夠與核酸形成復(fù)合物[19]。比起試劑盒法，SDS法和CTAB法成本低，DNA產(chǎn)量高、降解少[20]。此外，F(xiàn)aria Fatima等[21]在SDS與CTAB結(jié)合的情況下，又添加了甘露醇后提取的DNA產(chǎn)量高且腐殖酸的污染較小。

1.2.3 生物酶法 生物酶法是利用溶菌酶、蝸牛酶、蛋白酶K等裂解細(xì)胞。一般情況下，化學(xué)法與酶法聯(lián)合使用效果更好[15]。

一般來說，在加入溶菌酶后，控制溫度在37 ℃左右，而添加蛋白酶K后，控制溫度在60 ℃左右[22-23]。然而，將蛋白酶K置于37 ℃下[24]，或?qū)⑷芫钢糜?5 ℃下[25]，也能提取到較長的DNA片段。曲衍洪等[26]發(fā)現(xiàn)在環(huán)氧丙烷皂化廢水活性污泥中溶菌酶最適溫度為45 ℃，而非一般認(rèn)為的37 ℃，表明在不同的環(huán)境中提取DNA，酶的最適作用溫度也會發(fā)生變化。

通常會用上述3種方法或2種方法結(jié)合起來提取DNA，如閆亮珍等[14]將化學(xué)—物理法與酶—化學(xué)—物理法相比較，得出酶—化學(xué)—物理法提取的DNA能更好地體現(xiàn)生物多樣性，且操作上更方便、簡潔。王曉輝等[6]對化學(xué)法與酶—化學(xué)法進(jìn)行了比較，結(jié)果證明化學(xué)—酶法既得到了大片段DNA，又保證了DNA的高濃度。

1.3 蛋白質(zhì)的去除

細(xì)胞裂解之后，裂解液中除了DNA外還含有大量的蛋白質(zhì)，為了進(jìn)一步純化DNA，就必須除去蛋白質(zhì)。一般會使用苯酚—氯仿—異戊醇(25∶24∶1)與氯仿—異戊醇(24∶1)來抽提蛋白質(zhì)[27]。此外，還可以利用高鹽法與苯酚—氯仿—異戊醇或氯仿—異戊醇結(jié)合除蛋白質(zhì)，無論是先加鹽還是后加鹽，均比不加鹽溶液提取的效果好[17，28]。

1.4 DNA沉淀

用來沉淀DNA的試劑一般為無水乙醇或異丙醇。用無水乙醇沉淀，通常情況下用2～3倍體積無水乙醇在-20 ℃過夜沉淀或者在-70 ℃沉淀1 h，沉淀效果比較明顯，乙醇易揮發(fā)除去，但一般總體積較大。而用異丙醇沉淀，通常僅用0.5～0.6倍體積異丙醇，雖在室溫下沉淀下來的DNA量多，但易使鹽類共沉淀，且異丙醇難以揮發(fā)除去，必須用70%乙醇洗滌。因而在加入同樣多的試劑時，異丙醇沉淀下來的DNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于乙醇沉淀下來的[29]。閆建芳等[30]指出用異丙醇沉淀DNA時沉淀時間過長會降低DNA的純度。Zhang Xin等[31]曾用異丙醇在-20 ℃下沉淀，而陳琰等[27]認(rèn)為將異丙醇在-20 ℃沉淀會有鹽離子共沉淀出來，影響后續(xù)操作。此外，DNA含有大量的磷酸基團(tuán)而帶負(fù)電，當(dāng)被大量帶正電荷的基團(tuán)中和后更容易沉淀出來，因此異丙醇還可以結(jié)合醋酸鈉[32]一起使用來增強(qiáng)DNA的沉淀效果。另外，Tanima Paul等[33]利用聚乙二醇(PEG)和NaCl溶液也可以達(dá)到沉淀DNA的目的。

2 白酒窖池微生物DNA的提取

白酒的生產(chǎn)以窖池為基礎(chǔ)，發(fā)酵過程是龐大微生物種群在窖池的糟醅和窖泥中進(jìn)行復(fù)雜物質(zhì)能量代謝的過程。窖池微生物構(gòu)成極其多樣復(fù)雜，這些復(fù)雜的微生物在窖池中生長、繁殖、新陳代謝，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和酶，發(fā)生各種生化反應(yīng)，最后形成白酒中各種呈香物質(zhì)和重要有效成分。前人已經(jīng)在窖池微生物的分析方面作了大量的研究，但是人們對于微生物的認(rèn)識基本都是依賴于形態(tài)特征、生理學(xué)特性等傳統(tǒng)的分類鑒定方法[34-35]，對可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行研究，而對占微生物總體99%以上的不可培養(yǎng)微生物的研究較少[36]。

宏基因組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，使得人們對大量不可培養(yǎng)微生物的研究成為現(xiàn)實，微生物基因的可探測空間顯著增大。另外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，白酒窖池微生物多樣性的研究也已經(jīng)不局限在可培養(yǎng)微生物的范圍[37]。作為宏基因組學(xué)和微生物群落分子分析方法的基礎(chǔ)，最重要的環(huán)節(jié)就是從樣品中盡量提取出高質(zhì)量并具有代表性的微生物總基因組DNA。

2.1 大曲中DNA提取

環(huán)境中普遍含有的腐殖酸在大曲中也存在，因而，在從大曲中提取微生物基因組DNA時需要進(jìn)行脫腐處理。然而，先對曲樣進(jìn)行脫腐處理會使提取到的DNA總量變少[4]。不同時期的大曲曲塊硬，水分較少，進(jìn)而導(dǎo)致其具有高吸水性，如不進(jìn)行蒸餾水反復(fù)洗滌，則會導(dǎo)致抽提液被其過度吸收，進(jìn)而加入的溶菌酶等酶不起作用[14]，所以，可以先對其進(jìn)行充分研磨后再加入抽提液。

對大曲提取的方法無非也是分為物理法、化學(xué)法和酶法。閆亮珍等[14]采用酶—物理—化學(xué)法提取大曲DNA，與純物理法相比，獲得了質(zhì)量及純度更好的DNA，且后續(xù)試驗表明酶—物理—化學(xué)法提取獲得的高質(zhì)量DNA能全面反映汾酒釀造過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

2.2 酒醅中DNA提取

就酒糟的預(yù)處理來說，因為其含有酒精等微生物的次級代謝產(chǎn)物，因而將對后續(xù)加入的溶菌酶、溶壁酶、蛋白酶K等活性產(chǎn)生不利影響，故可用無菌水對其反復(fù)洗滌，進(jìn)而有利于DNA的提取[14]。而沈才萍等[38]在此基礎(chǔ)上，采用SDS高鹽+蛋白酶K的方法提取得到酒醅中的微生物總DNA，分別利用無菌水、TENP以及PBS緩沖液對糟醅進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果證明，用PBS緩沖液預(yù)處理后獲得的基因組DNA其DGGE 圖譜中條帶明亮、豐度高，能很好地反映樣品細(xì)菌的多樣性，有利于相關(guān)分子生物學(xué)分析。李德林等[39]對比了SDS高鹽提取法和CTAB提取方法在酒醅中微生物基因組DNA提取的效果，發(fā)現(xiàn)石英砂+CTAB法獲得的DNA濃度最大，而液氮+SDS+溶菌酶法獲得的總DNA純度最高。

2.3 窖泥中DNA提取

對于窖泥微生物DNA的提取是近幾年才發(fā)展起來的，但并沒有找到一種專有的從窖泥微生物中提取DNA的方法。窖泥水分較多，故在預(yù)處理時常采用冷凍干燥窖泥的方法[40]除去窖泥水分。邊名鴻等[41]采用在高鹽提取緩沖液中裂解細(xì)胞并在加入SDS、溴化十六烷基三甲銨和蛋白酶K后持續(xù)加熱2～3 h的方法成功將窖泥微生物DNA提取出來，擴(kuò)增古菌16S rDNA序列，構(gòu)建了古菌16S rDNA文庫。劉金英等[42]用不同方法提取窖泥的微生物DNA，結(jié)果表明用化學(xué)—酶法提出的DNA產(chǎn)率高且較純，并且在粗提取過程中，還發(fā)現(xiàn)了DNA含量與液相層中的黃褐色深度呈正比關(guān)系。

3 大片段DNA的提取

環(huán)境微生物中可培養(yǎng)微生物僅占不到1%[43]，嚴(yán)重影響了人們對環(huán)境微生物的了解及利用，故建立一個宏基因組文庫對微生物的研究及利用尤為重要。宏基因組揭示了生物群落多樣性，進(jìn)而反映了基因組的編碼功能多樣性，且其中絕大部分是未知基因[44]。根據(jù)插入DNA 片段的大小，宏基因組文庫常常被劃分為小插入片段文庫和大插入片段文庫兩大類[45]。穩(wěn)定的大片段基因組文庫能保證基因簇的完整性，更利于目的基因的結(jié)構(gòu)及功能分析[46]，因此大片段DNA的提取，是建立高質(zhì)量宏基因組文庫的關(guān)鍵。

大片段DNA的提取既可以利用間接提取法，也可以利用直接提取法。直接提取法相對間接提取法耗時短，但非DNA物質(zhì)殘留較多，且有可能對DNA進(jìn)行降解，從而提取不到大片段的DNA[47]，因此在直接提取前必須進(jìn)行必要的預(yù)處理，除去大部分對DNA提取有較大影響的雜質(zhì)。蔣云霞等[48]通過改良后的高鹽、SDS-CTAB熱裂解直接提取法與電洗脫法聯(lián)用能高效構(gòu)建紅樹林土壤微生物大片段宏基因組文庫，其包含克隆子的平均插入片段均大于35 kbp。但僅用CTAB、SDS等基因組DNA常用提取方法則因為提取過程需要較多步驟的震蕩等操作會使基因組DNA斷裂，無法獲得大片段DNA。而低熔點瓊脂糖包埋法則可以保護(hù)DNA免受降解，盡可能地減少裂解處理過程中的藥物和機(jī)械損傷[49]，是一種高效、簡便的大片段DNA制備方法。茍敏等[50]通過用瓊脂糖包埋法，與試劑盒法及CTAB法對比發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖包埋法提取出來的DNA分子片段最長，且純度較高。

4 總結(jié)及展望

隨著人們對微生物DNA提取手段的改進(jìn)，涌現(xiàn)了各種各樣高效的提取方法。如何快速、經(jīng)濟(jì)地從各種復(fù)雜的樣本中提取高純度、高產(chǎn)量的DNA已經(jīng)成為生物研究的一個非常重要的基礎(chǔ)。而普遍適用的即為酶—化學(xué)結(jié)合法提取DNA，然而，由于在不同樣品中存在樣品本身各自特性的差異，還沒有一種方法可以適用于所有的樣品，也沒有一種方法可以滿足所有的后續(xù)試驗的要求，故在選擇DNA提取方法時，要根據(jù)樣品的特性和試驗的目的選擇合適的方法。本文對近年來國內(nèi)外的各種DNA提取方法進(jìn)行比較表明：簡化操作程序，縮短操作時間，減少提取過程中對DNA的損傷，保護(hù)DNA的完整性，已成為環(huán)境微生物DNA研究的發(fā)展趨勢。

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Progress of Study on Extraction Methods of Environmental Microbial DNA

YANG Jing1,2ZHANGJing1,2ZOUWei1,2ZHAOXing-xiu1,2ZHAOChang-qing1,2

(1.CollegeofBioengineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong,Sichuan643000,China; 2.LiquorMakingBio-Technology&ApplicationofKeyLaboratoryofSichuanProvince,Zigong,Sichuan643000,China)

Environmental microbial DNA extraction is the foundation of microbial community research by molecular biology techniques, and its structural integrity and the purity of DNA extracted is directly related to the subsequent experiment results. DNA extraction method is not a unified standard because of various environmental samples, including water, soil and activated sludge, the traditional fermented food, liquor-making environment, etc. Now, there are many methods of DNA extraction, they can be divided into direct and indirect extraction ones. The direct extraction methods are simple, less time-consuming, while presenting impurities. However, complex indirect extraction operations are time-consuming, but the products are pure. Based on the comparison of the different DNA extraction methods, we focus on the research progress of DNA extractions of liquor brewing environment and the large fragments.

DNA extraction; liquor brewing; large fragment of DNA

四川省教育廳項目(編號：15ZA0226)；省部級重點實驗室項目(編號：NJ2014-06)；四川省教育廳項目(編號：15ZB0204)

陽靜，男，四川理工學(xué)院在讀本科生。

張靜(1981—)，女，四川理工學(xué)院講師，博士。 E-mail:jingzhang3019@126.com

2017-01-07

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.042