ROCK I/II基因下調(diào)對TGF-β1誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細(xì)胞遷移及增殖的影響

汪海波，朱健，郗二平，張瑜，王正，謝彪，朱水波

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬武漢臨床醫(yī)學(xué)院/中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院 心胸外科，湖北 武漢 430070）

主動脈夾層（aortic dissection，AD）是一種在主動脈中膜層出現(xiàn)退化，變性、壞死等病變基礎(chǔ)上，內(nèi)膜撕裂、血液經(jīng)裂口注入主動脈壁，使中膜從外膜剝脫的一種病變。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是主動脈中膜層的主要成分，其增殖遷移能力的改變在AD形成中發(fā)揮著重要作用。Rho激酶（Rhoassociated coiled-coil containing protein kinase，ROCK）是最早發(fā)現(xiàn)的Rho下游效應(yīng)分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一。ROCK與多種心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，并且在血管平滑肌的收縮功能中扮演者重要角色。ROCK包括ROCK I和ROCK II兩種亞型，兩者的氨基酸序列具有65%的同源性，其中激酶區(qū)的同源性高達(dá)90%[1]。在大鼠平滑肌細(xì)胞的遷移中，ROCK I起主導(dǎo)作用，而ROCK II的作用不明顯；在大鼠平滑肌細(xì)胞的增殖中，兩者的作用均不明顯[2]。近期有研究[3]顯示，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）可呈濃度依賴性誘導(dǎo)人主動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而促使AD的發(fā)生。本研究通過下調(diào)VSMC的ROCK I和ROCK II基因，觀察其在TGF-β1刺激下對人主動脈平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：人主動脈平滑肌細(xì)胞（H AVSMCs），購于美國ATCC公司。主要試劑：TGF-β1（美國Peprotech公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰酶-EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone）；PBS（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液（100×）（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；siRNA（廣州銳博）；Y-27632（美國Selleck）；Opti-MEM I Reduced serum medium（美國Gibco）；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（美國Invitrogen）；GAPDH（ab37168）、ROCK I（ab45171）以及ROCK II（ab125025）（abcam公司）；HRP-Goat anti Rabbit（074-1506）（KPL）；GNM14170型D-Hanks（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；AS1086型結(jié)晶紫染液（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司）；CCK-8檢測試劑盒（C0038）（碧云天生物技術(shù)有限公司）。主要儀器：SCO6WE型CO2恒溫培養(yǎng)箱（SHEL LAB）；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺（蘇凈安泰）；IX51型倒置顯微鏡（OLYMPUS）；L400型離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；3422型Transwell板（Corning）；DR-200Bs型酶標(biāo)檢測儀（Diatek）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2條件下用含10%FBS的高塘DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) HA-VSMCs。培養(yǎng)基按照1:100加入青鏈霉素混合液（含1 000 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素）。HA-VSMCs培養(yǎng)達(dá)85%～90%融合率時用胰酶消化細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，稀釋至所需濃度，按照需要進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)及后續(xù)實驗。

1.2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染 ⑴ 轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化收集細(xì)胞，加入不含抗生素的培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，以每孔2 mL接種至6孔板。轉(zhuǎn)染時要求細(xì)胞匯合度為50%～60%。⑵ 轉(zhuǎn)染液制備（siRNA儲存液濃度為20 μM），每孔用量如下：用 190 μL Opti-MEI無血清培養(yǎng)基將 10 μL siRNA稀釋，輕輕混勻。使用前輕輕搖勻Lipofectamine 2000，取 20 μL Lipofectamine 2000 在 18 μL 無血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5 min。將前2步縮稀釋的siRNA和Lipofectamine 2000混合（總體積400 μL），輕輕混勻，室溫靜置20 min。⑶ 將孔板內(nèi)的培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染孔加1.6 mL，空白孔加2 mL。⑷ 在需要轉(zhuǎn)染的孔中加入400 μL轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。⑸ 37 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4～6 h后，細(xì)胞換液為含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，記錄圖片，48 h后可檢測蛋白表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù)實驗分組和藥物干預(yù)（一） ⑴ 空白對照組：正常細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑵ ROCK I siRNA組：ROCK I siRNA轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑶ ROCK II siRNA組：ROCK II siRNA轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑷ TGF-β1組：正常細(xì)胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑸ ROCK I siRNA+TGF-β1組： 轉(zhuǎn) 染 ROCK I siRNA的細(xì)胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑹ ROCK II siRNA+TGF-β1組：轉(zhuǎn)染ROCK II siRNA的細(xì)胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.2.4 Western blot檢測 上述細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)處理后，PBS洗2～3次，加入適量RIPA裂解液，收集細(xì)胞至EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度；根據(jù)蛋白分子量配制不同濃度SDS-PAGE，樣品蛋白上樣量為40 μg/孔，電泳條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V，至溴酚藍(lán)到達(dá)膠板下沿，300 mA電流60 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫?fù)u床封閉1 h。除去封閉液，加入用封閉液稀釋好的ROCK I和ROCK II抗體4 ℃過夜；TBST充分洗滌PVDF膜3次，5 min/次，加入用封閉液稀釋好的二抗，室溫?fù)u床孵育30 min；再用TBST充分洗滌PVDF膜3次，5 min/次，加入適量ECL底物，X光膠片壓片后放入顯影液顯影、定影液定影；使用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值，將目的灰度除以內(nèi)參的灰度，以比較各組目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞干預(yù)實驗分組和藥物干預(yù)（二） ⑴ 空白對照組：正常細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑵TGF-β1組：正常細(xì)胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑶ ROCK I siRNA組：轉(zhuǎn)染Rock I siRNA的細(xì)胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑷ ROCK II siRNA組：轉(zhuǎn)染ROCK II siRNA的細(xì)胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；⑸ Y-27632組：Y-27632是ROCK I選擇性抑制劑，正常細(xì)胞用10 μM Y-27632預(yù)處理1 h，之后換培養(yǎng)液，在含5 ng/mL TGF-β1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.2.6 細(xì)胞遷移實驗（Transwell試驗） ⑴ 配制染液：0.5%的結(jié)晶紫溶液，用時用PBS溶液1:5稀釋成0.01%的結(jié)晶紫染液；⑵ 將細(xì)胞制成105個/mL懸液，取1 mL細(xì)胞懸液于1 500 r/min離心5 min，棄上清；⑶ 加入1 mL無血清培養(yǎng)基，吹打均勻后取200 μL細(xì)胞懸液放入Transwell小室中；⑷ 24孔板中加入500 μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，將小室放入板中；⑸ 37℃下于CO2（含量5%）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；⑹ 染色：將小室取出，用PBS洗去培養(yǎng)基，用棉簽將上室中的膠和細(xì)胞擦除干凈，結(jié)晶紫染色10 min，洗去表面的結(jié)晶紫，于倒置顯微鏡下對非細(xì)胞接種側(cè)拍照。

1.2.7 細(xì)胞增殖試驗（CCK-8試驗） ⑴ 將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液，按10 000細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2（5%）培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h以貼壁；⑵ 繼續(xù)培養(yǎng)24 h分別更換為100 μL細(xì)胞樣品各自對應(yīng)的含有一定濃度藥物的培養(yǎng)基，對照組更換為含溶劑的培養(yǎng)基，每個濃度的樣本設(shè)5個重復(fù)；⑶ 所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1～4 h；⑷ 使用酶標(biāo)儀測定450 nm光吸收值，以溶劑處理的細(xì)胞為對照組，不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效果鑒定及不同處理后ROCK I與ROCK II蛋白表達(dá)

對HA-VSMCs進(jìn)行ROCK I siRNA和 ROCK II siRNA 轉(zhuǎn)染24 h后使用倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，鏡下可見大量平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功（圖1）。轉(zhuǎn)染后48 h，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ROCK I和ROCK II蛋白表達(dá)水平。與空白對照組比較，ROCK I siRNA組ROCK I蛋白表達(dá)減少，TGF-β1組ROCK I蛋白表達(dá)增加（均P＜0.05）；與TGF-β1組相比，ROCK I siRNA+TGF-β1組ROCK I蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），ROCK II siRNA+TGF-β1組對ROCK I蛋白表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。與空白對照組比較，ROCK I siRNA組ROCK II蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），而TGF-β1組ROCK II蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與TGF-β1組比較，ROCK I siRNA+TGF-β1組ROCK II蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），ROCK II siRNA+TGF-β1組ROCK II蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）（圖2）。

圖1 熒光轉(zhuǎn)染結(jié)果（×100） A：ROCK I siRNA轉(zhuǎn)染；B：ROCK II siRNA轉(zhuǎn)染Figure 1 Fluorescence transfection results (×100) A: ROCK I siRNA transfection; B:ROCK II siRNA transfection

圖2 Western bolt檢測ROCK I和ROCK II蛋白的表達(dá)Figure 2 Western blot analysis of ROCK I and ROCK II protein expressions

2.2 ROCK I和ROCK II對TGF-β1誘導(dǎo)的HAVSMCs遷移作用的影響

與空白對照組相比，TGF-β1組HA-VSMCs遷移細(xì)胞數(shù)增加[（208.3±18.9 ）vs. （23.8±1.5），P＜0.0 5]；與T G F-β 1組相比，R O C K I siRNA+TGF-β1組、Y-27632+TGF-β1組細(xì)胞遷移數(shù)減少[（61.0±1.8） vs. （208.3±18.9）；（63.3±7.4） vs. （208.3±18.9），均P＜0.05]，而ROCK II siRNA+TGF-β1組對細(xì)胞遷移無明顯變化（P＞0.05）；與Y-27632+TGF-β1組比較，ROCK I siRNA+TGF-β1組細(xì)胞遷移數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異[（61.0±1.8） vs. (63.3±7.4)，P＞0.05]，而ROCK II siRNA+TGF-β1組細(xì)胞遷移數(shù)增加[（274.5±10.0 ）vs.( 63.3±7.4)，P＜0.05]。對遷移后Transwell小室進(jìn)行結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，TGF-β1組和ROCK II siRNA+TGF-β1組平滑肌細(xì)胞數(shù)量較多；C o n t r o l組、R O C K I siRNA+TGF-β1組和Y-27632+TGF-β1組平滑肌細(xì)胞數(shù)量較少（圖3）。

圖3 細(xì)胞遷移實驗 A：結(jié)晶紫染色法觀察（×100）；B：各組遷移細(xì)胞數(shù)比較Figure 3 Cell migration assay A: Crystal violet staining observation (×100); B: Comparison of the numbers of migrating cells among groups

2.3 ROCK I和ROCK II對TGF-β1誘導(dǎo)的HAVSMCs增殖的影響

與空白對照組相比，TGF-β1組OD值升高[（1.350±0.057） vs. (252±0.061)，P＜0.05]；與TGF-β1組比較，ROCK I siRNA+TGF-β1組、ROCK II siRNA+TGF-β1組、Y-27632+TGF-β1組OD值均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（圖4）。

圖4 各組對HA-VSMCs增殖情況比較Figure 4 Comparison of proliferations of among each group of HA-VSMCs

3 討 論

近年來，隨著生活水平的提高，AD的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢。目前，有關(guān)主動脈夾層的回顧性研究分析證實，胸主動脈腔內(nèi)修復(fù)術(shù)（thoracic endovascular aortic repair，TEVAR）是治療AD的首選治療方案[4-9]。AD常表現(xiàn)為突然地劇烈撕裂樣或剝脫樣疼痛，其起病急、進(jìn)展快且病死率高[10]。因此，有關(guān)AD的相關(guān)基礎(chǔ)研究也成為了目前熱點課題。

目前研究表明，AD的起始病變位于主動脈中膜層VSMC。在病理刺激下，VSMC的異常增殖與遷移可導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)等一系列病理變化。Rho蛋白家族是一類小GTP結(jié)合蛋白，目前研究最多是Rho、Rac和Cdc42 3個亞家族，可通過下游效應(yīng)分子的活性參與細(xì)胞骨架動力學(xué)。ROCK是首個被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白下游效應(yīng)分子，與Rho蛋白一起調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白，與細(xì)胞的增殖遷移等多種生物功能密切相關(guān)[11]。ROCK在缺氧環(huán)境下促進(jìn)VSMC的增殖與遷移，且可通過促進(jìn)MMP-2表達(dá)從而促使VSMC增殖[12-13]。ROCK包括ROCK I和ROCK II兩種亞型。有研究通過siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)ROCK I和ROCK II基因表達(dá)證實，ROCK I在大鼠平滑肌細(xì)胞的遷移中起主導(dǎo)作用，而ROCK II的作用不明顯；在大鼠平滑肌細(xì)胞的增殖中，兩者的作用均不明顯。同時又有人通過過表達(dá)ROCK I基因證實，ROCK I在大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞的遷移中起主導(dǎo)作用[14]；通過自行設(shè)計的針對ROCK II的siRNA轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞使其ROCK II基因下調(diào)后觀察細(xì)胞遷移數(shù)量并未受到影響[15]。在AD患者病變組織的中膜層中發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時有研究[16-18]顯示TGF-β1可呈濃度依賴性誘導(dǎo)HA-VSMCs發(fā)生增殖與遷移，而VSMC是主動脈中膜的主要成分。因此，TGF-β1在體內(nèi)的表達(dá)增加誘導(dǎo)HA-VSMCs的增殖與遷移可能是促使主動脈夾層形成的一個重要因素。

為探討R OCK I和ROC K I I對TGF-β1誘導(dǎo)的HA-VSMCs遷移增殖的影響。本研究利用siRNA技術(shù)，使HA-VSMCs的ROCK I和ROCK II基因表達(dá)下調(diào)，并分別對比加入TGF-β1組和未加入TGF-β1組的ROCK I和ROCK II蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1對轉(zhuǎn)染后的蛋白表達(dá)有顯著影響。又通過Transwell試驗和CCK-8試驗檢測ROCK兩種亞型對TGF-β1誘導(dǎo)的HA-VSMCs遷移和增殖的影響。結(jié)果顯示，與TGF-β1組相比，ROCK I siRNA+TGF-β1組和Y-27632+TGF-β1組對H A-V S M C s遷移起抑制作用，R O C K I I siRNA+TGF-β1組則無明顯作用。與TGF-β1組相比，ROCK I siRNA、ROCK II siRNA、Y-27632對HA-VSMCs增殖均沒有明顯影響。由此可見，ROCK I在TGF-β1誘導(dǎo)的HA-VSMCs遷移中起重要作用，而ROCK II的作用不明顯；ROCK I和ROCK II對TGF-β1誘導(dǎo)的HA-VSMCs增殖的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。

在AD患者中膜層平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖能力明顯增強(qiáng)，發(fā)生了由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)化[19]。有研究[20]顯示，TGF-β1可誘導(dǎo)HA-VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，其收縮型的標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白（smooth muscle α-actin，α-SMA）、平滑肌22α（smooth muscle 22α，SM22α）減少，合成型的標(biāo)志蛋白骨橋蛋白（osteopontin，OPN）增加。因此，下一步將進(jìn)一步探討ROCK I和ROCK II對TGF-β1誘導(dǎo)的HA-VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響，對主動脈夾層的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

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