三陰性乳腺癌組織中BCL11A的表達(dá)及新輔助化療的影響

王守滿，李丹旎，于子棋，陳飛宇，胡純，張克兢

（1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 乳腺外科，長(zhǎng)沙 湖南 410008；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血管甲狀腺乳腺外科，廣東 湛江 524000）

大約有15%的乳腺癌患者ER、PR、HER-2均表達(dá)陰性，稱作三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）[1]。TNBC較其他類(lèi)型乳腺癌預(yù)后差，病理類(lèi)型多為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、生存期短和病死率高等特點(diǎn)[2-3]。TNBC治療手段匱乏，化療是其唯一有效綜合治療手段[4-6]。BCL11A基因，最早于2000年在T（2；14）（p16；q32.3）異位的慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)[7]被發(fā)現(xiàn)，位于人類(lèi)基因組的2p13位點(diǎn)，在物種間高度保守，表達(dá)于胎肝、骨髓、腦組織中，并在B淋巴細(xì)胞[8]、早期T祖細(xì)胞、淋巴系祖細(xì)胞以及造血干細(xì)胞等造血組織中高表達(dá)，在B淋巴細(xì)胞發(fā)育增殖中起到重要的作用[9-11]。Khaled等[12]為了識(shí)別TNBC潛在致癌基因，從歐美人群的腫瘤大數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出并證實(shí)BCL11A基因是TNBC的致癌基因。本研究旨在研究BCL11A在我國(guó)TNBC中的表達(dá)水平及其與其他類(lèi)型乳腺癌表達(dá)水平的差異，初步探討新輔助化療對(duì)BCL11A表達(dá)的影響，分析其在TNBC中與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，為尋求TNBC靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2013年1月—2015年12月收治在湘雅醫(yī)院乳腺科可手術(shù)的浸潤(rùn)性乳腺癌患者的臨床病理資料，從TNBC患者中隨機(jī)抽取有新輔助化療前后2次病理結(jié)果的43例TNBC，未經(jīng)新輔助化療的非TNBC中隨機(jī)抽取49例乳腺管腔型乳腺癌，50例HER-2陽(yáng)性型乳腺癌。

1.2 方法及試劑

應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BCL11A蛋白。兔抗人BCL11A單克隆抗體（ab191402），購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，免疫組化檢測(cè)試劑盒（sp9000，羊抗兔），購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行造作。

1.3 結(jié)果判斷

BCL11A在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)，染色呈現(xiàn)出黃色、棕黃色或棕褐色。定性分析：每張切片均隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野（400倍），以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈清晰棕黃色著色作為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例計(jì)0、1、2、3、4分，分別對(duì)應(yīng)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞、≤25%、26%～50%、51%～75%、＞75%。按陽(yáng)性細(xì)胞著色程度記分為0、1、2、3分，依次對(duì)應(yīng)無(wú)著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色。上述兩種記分相加，取2名病理科教授評(píng)分平均值。0～1分記為陰性（-）；2～3分記為弱陽(yáng)性（+）；4～5分記為中等陽(yáng)性（++）；6～7分記為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。定量分析：為了更客觀的評(píng)價(jià)抗體的特異性，將上述染色的切片，在顯微鏡高倍鏡視野（400倍）下定位后，用彩色攝像機(jī)提取細(xì)胞圖像輸入Image-Pro Plus（IPP）圖像處理分析軟件，通過(guò)圖像分割、統(tǒng)計(jì)，獲得各例病理切片細(xì)胞BCL11A的平均吸光光密度值（u值），u值越大，染色越深。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料均采用χ2檢驗(yàn)，所有計(jì)量數(shù)據(jù)先采用方差齊性分析是否屬于正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析新輔助化療前后BCL11A表達(dá)水平的差異，采用單樣本ANOVA方差分析對(duì)3類(lèi)乳腺癌的BCL11A表達(dá)水平的差異進(jìn)行定量分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCL11A在不同類(lèi)型乳腺癌中的表達(dá)情況

對(duì)4 3例TNBC（化療前）、49例管腔型、50例HER-2陽(yáng)性乳腺癌組織BCL11A陽(yáng)性表達(dá)率分別進(jìn)行定性與定量分析（圖1）（表1）。結(jié)果顯示，BCL11A在TNBC組、管腔型組、HER-2陽(yáng)性組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.7%（33/43）、26.5%（13/49）、32.0%（16/50），TNBC組BCL11A陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于管腔型組和HER-2陽(yáng)性組（均P＜0.05）；TNBC組BCL11A表達(dá)量u值明顯高于管腔型組、HER-2陽(yáng)性組（均P＜0.05）（圖2）。

圖1 BCL11A免疫組化染色（×400） A：BCL11A在TNBC中陽(yáng)性表達(dá)；B：BCL11A在TNBC陰性表達(dá)；C：BCL11A在非TNBC中陽(yáng)性表達(dá)；D：BCL11A在非TNBC中陰性表達(dá)Figure 1 Immunohistochemical staining for BCL11A expression (×400) A: Positive BCL11A expression in TNBC tissue; B: Negative BCL11A expression in TNBC tissue; C: Positive BCL11A expression in non-TNBC tissue; D: Negative BCL11A expression in non-TNBC tissue

表1 BCL11A在不同類(lèi)乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率[n（%）]Table 1 Positive expression rates of BCL11A in different types of breast cancer tissues [n (%)]

圖2 BCL11A在3類(lèi)乳腺癌組織中的表達(dá)量比較Figure 2 Comparison of BCL11A expression levels among the three types of breast cancer tissues

2.2 BCL11A在TNBC組織中的表達(dá)臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系

在TNBC中，BCL11A的陽(yáng)性表達(dá)與原發(fā)腫塊大小明顯有關(guān)（P＜0.05）。BCL11A的陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)、Ki67、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、乳腺癌家族史之間無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表2）。

表2 BCL11A表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of BCL11A expression with the clinicopathologic features of TNBC [n (%)]

2.3 新輔助化療對(duì)BCL11A表達(dá)水平的影響

對(duì)43例TNBC患者新輔助化療前后的病理切片進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示，BCL11A在化療前組和化療后組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.7%（33/43），55.8%（24/43），化療前組BCL11A陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于化療后組（P=0.04）；對(duì)u值進(jìn)行定量分析，化療前組u值明顯大于化療后組（P=0.03）（圖3）（表3）。

圖3 TNBC組織新輔助化療前后BCL11A表達(dá)量比較Figure 3 Comparison of the BCL11A expression levels in TNBC tissue before and after neoadjuvant chemotherapy

表3 TNBC組織新輔助化療前后BCL11A的表達(dá)情況（n=43）Table 3 BCL11A expressions in TNBC tissue before and after neoadjuvant chemotherapy (n=43)

3 討 論

TNBC最初在2005年10月提出，隨后該名詞出現(xiàn)在600多篇文章中[13]，TNBC具有平均發(fā)病年齡小，組織學(xué)分級(jí)高，侵襲性強(qiáng)，細(xì)胞增殖率高，易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，化療是TNBC唯一有效的全身綜合治療手段[4-6]。本研究結(jié)果表明BCL11A在TNBC化療前組的表達(dá)率明顯高于非TNBC組，TNBC化療前組、管腔型組、HER-2陽(yáng)性組中BCL11A的陽(yáng)性率分別為76.7%（33/43）、26.5%（13/49）、32.0%（16/50），與Khaled等[12]報(bào)道的BCL11A在TNBC，官腔型，HER-2陽(yáng)性型中陽(yáng)性率（分別為67%、12%、29%）基本一致。表明BCL11A不僅在歐美人的TNBC中高表達(dá)，在我國(guó)人群中的TNBC中也是高表達(dá)，且陽(yáng)性率明顯高于其他類(lèi)型的乳腺癌。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新輔助化療后BCL11A陽(yáng)性率下降，BCL11A在TNBC的表達(dá)與原發(fā)腫塊的大小有關(guān)。

BCL11A基因，最早于2000年在T（2；14）（p16；q32.3）異位的慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)[7]，位于人類(lèi)基因組的2p13位點(diǎn)，在物種間高度保守。研究[14]發(fā)現(xiàn)BCL11A能與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的5'-GGCCGG-3'基序結(jié)合，影響組蛋白H3/H4的去乙酸化，從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，但可被逆轉(zhuǎn)錄入病毒結(jié)合。BCL11A主要表達(dá)于胎肝、骨髓、腦組織中，并在B淋巴細(xì)胞、早期T祖細(xì)胞、淋巴系祖細(xì)胞以及造血干細(xì)胞等造血組織中高表達(dá)，在B淋巴細(xì)胞發(fā)育增殖中起到重要的作用[9-10]。BCL11A是B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。˙CL）家族的一員，是一種原癌基因，而B(niǎo)CL11中另一成員BCL11B是一個(gè)抑癌基因，其起到增加抗DNA損傷的作用[15-16]。以前的研究報(bào)道，增強(qiáng)的BCL11A表達(dá)可以抑制P21誘導(dǎo)，P21蛋白可以抑制白血病細(xì)胞復(fù)制及延長(zhǎng)細(xì)胞周期，但BCL11A過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)P21的活性，從而出現(xiàn)白血病細(xì)胞復(fù)制加強(qiáng)及白血病細(xì)胞周期縮短，同時(shí)研究表明BCL11A高表達(dá)提示急性髓系白血病患者預(yù)后較差[17]。Yin等[18]也報(bào)道BCL11A作為癌基因，在小鼠不存在NF1的情況下可能導(dǎo)致白血病，可能是通過(guò)抑制P21誘導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。Khaled等[12]研究顯示BCL11A高表達(dá)能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的集落生成及激發(fā)腫瘤的形成，BCL11A在TNBC中同樣是原癌基因。本研究同樣發(fā)現(xiàn)TNBC患者的原發(fā)腫塊大小與BCL11A的表達(dá)有關(guān)，臨床資料說(shuō)明BCL11A存在促進(jìn)乳腺癌腫瘤組織生長(zhǎng)中的作用，但其在乳腺癌中的具體機(jī)制需進(jìn)一步探索。

本研究另一結(jié)果提示經(jīng)過(guò)新輔助化療后，TNBC中BCL11A的表達(dá)水平及表達(dá)率降低，新輔助化療前后BCL11A表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。新輔助化療是乳腺癌治療中的重要一環(huán)節(jié)，可通過(guò)新輔助化療予以患者降期，從而使不可手術(shù)患者達(dá)到手術(shù)條件，并在一定程度上判斷藥物的敏感性[19-21]。新輔助化療影響B(tài)CL11A表達(dá)的機(jī)制，現(xiàn)階段暫時(shí)缺乏相關(guān)研究。主要有以下可能：有研究[22-24]表明，新輔助化療后，Ki67及p53腫瘤標(biāo)記物表達(dá)水平可能較化療前有所下降，其主要原因是與化療藥物使腫瘤細(xì)胞增殖能力下降有關(guān)，即新輔助化療影響了細(xì)胞增殖能力，從而降低了Ki67及p53的表達(dá)。研究[25]表明，BCL11A編碼的蛋白在細(xì)胞增殖和抗衰亡等方面起作用。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，化療可能影響了BCL11A編碼蛋白對(duì)于細(xì)胞增殖的作用，從而導(dǎo)致化療前后BCL11A蛋白表達(dá)的水平有所下降。另一種推測(cè)，由于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，在同一患者腫瘤組織中，BCL11A在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)不盡相同，因化療藥物往往對(duì)于增殖能力強(qiáng)的癌細(xì)胞殺傷力更大，新輔助化療清除了大量BCL11A表達(dá)陽(yáng)性的癌細(xì)胞，從而B(niǎo)CL11A表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞比例相對(duì)降低。在后續(xù)研究中，筆者將進(jìn)一步探索這種現(xiàn)象是否與化療療效及患者預(yù)后存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，BCL11A在TNBC中高水平表達(dá)，其表達(dá)水平受新輔助化療影響，其代表的臨床意義有待進(jìn)一步深入研究。

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