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    發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的檢測與提取研究

    2017-03-30 02:05:36王利杰
    科技與創(chuàng)新 2016年22期
    關(guān)鍵詞:維生素B12高效液相色譜法發(fā)酵液

    王利杰

    摘 要:采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測了發(fā)酵液中維生素B12的含量,使用費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞破碎提取維生素B12。結(jié)果顯示,羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素的回收率分別為92.43%,97.56%和96.45%.費(fèi)氏丙酸桿菌的質(zhì)量濃度分別為43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。經(jīng)超聲波破碎,經(jīng)測定,維生素B12的產(chǎn)量分別為13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。維生素B12經(jīng)微波加熱法獲得的提出率最大,其次為煮沸法、超聲法和高壓均質(zhì)法。HPLC具有良好的重復(fù)性和較快的分析速度,而在費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞破碎提取中,微波加熱法和煮法法值得推廣。

    關(guān)鍵詞:發(fā)酵液;維生素B12;高效液相色譜法;超聲波

    中圖分類號(hào):TQ924 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.15913/j.cnki.kjycx.2016.22.106

    維生素B12又被稱為鈷胺素,主要是通過微生物發(fā)酵獲取的,其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面。在實(shí)踐中,常見的檢測方法有微生物法、間接檢測法等,其中,HPLC的使用頻率最高。但是,因?yàn)榫S生素B12的發(fā)酵周期過長、發(fā)酵物種繁多,所以,急需構(gòu)建準(zhǔn)確、簡便、高效的檢測方法。目前,關(guān)于維生素B12的檢測和提取的研究報(bào)道比較少。因此,本文利用HPLC檢測了維生素B12,并借助大孔樹脂吸附法進(jìn)行了提取,效果顯著,具體情況如下。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)一:費(fèi)氏丙酸桿菌,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的玉米漿,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的硫酸銨,高效液相色譜儀,超聲波細(xì)胞破碎儀,高速離心機(jī),大容量離心機(jī),純水機(jī),分析純,色譜柱為5 μm,(4.7×25.0)cm。

    實(shí)驗(yàn)二:菌種、培養(yǎng)基同實(shí)驗(yàn)一,采用高效液相色譜儀,高速離心機(jī),大容量離心機(jī),超聲波細(xì)胞破碎儀,微波爐,高壓均質(zhì)機(jī),考馬斯亮藍(lán)染液,色譜柱5 μm,(4.7×25.0)cm。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    實(shí)驗(yàn)一:培養(yǎng)費(fèi)氏丙酸桿菌,利用生理鹽水清洗菌體,靜置30 ℃,培養(yǎng)50 h。接種發(fā)酵培養(yǎng)基后,靜置30 ℃,培養(yǎng)100 h,發(fā)酵后40 h,添加二甲基苯并咪唑,誘導(dǎo)菌體,積累維生素B12,離心4 000 r/min,獲取菌體。具體實(shí)驗(yàn)有,重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn),即稱取5份菌體,質(zhì)量相同,制備樣品,添加等量羥基鈷胺素和甲基鈷胺素,置于4 ℃冰箱內(nèi),避光保存,檢測間隔時(shí)間為1 h/次,分析樣品5 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

    實(shí)驗(yàn)二:配置不同濃度的血清白蛋白溶液,取0.1 mL,加入考馬斯亮藍(lán)染液5 mL。維生素B12的提取方法有4種,即超聲法,稱取菌體,放置在小燒杯內(nèi),離心后,溶解菌體,選取不同時(shí)間,探討其提取效率,取上清,測定蛋白質(zhì)釋放率,除蛋白質(zhì)后測定維生素B12的含量;煮沸法,定容后,煮沸,離心,過濾上清液后,測定維生素B12的含量。此外,還包括微波加熱法和高壓均質(zhì)法,此處不一一闡述。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)一:細(xì)胞破碎液處理后,獲得了HPLC色譜圖,羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素均在25 min內(nèi)完全分離,各自保留時(shí)間為10.9 min、18.5 min、22.4 min,細(xì)胞破碎液中雜質(zhì)6 min內(nèi)被洗脫,借助梯度洗脫,分離了脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。三類不同濃度的鈷胺素與色譜峰面積呈線性關(guān)系,因其對(duì)光線敏感,操作時(shí)應(yīng)避光,質(zhì)量濃度為10~200 μg/mL,三者線性關(guān)系良好。維生素B12經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn),5次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于2.5%,均在允許誤差范圍內(nèi)。此結(jié)果表明,儀器具有較高的精密度,分析方法具有良好的重復(fù)性。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),維生素B12置于避光環(huán)境中,5 h內(nèi)穩(wěn)定,三者的回收率分別為92.43%,97.56%,96.45%. 費(fèi)氏丙酸桿菌的質(zhì)量濃度分別為43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。經(jīng)超聲波破碎,測定維生素B12的產(chǎn)量分別為13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。

    實(shí)驗(yàn)二:費(fèi)氏丙酸桿菌菌體采取不同的方法提取維生素B12,提出率最大的為微波加熱法,其次為煮沸法、超聲法和高壓均質(zhì)法,分別為100.00%,97.67%,89.65%和88.63%.

    4 討論

    經(jīng)微生物發(fā)酵獲取維生素B12常見的有羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。為了快速測定發(fā)酵液中維生素B12的含量,本文采用了HPLC方法,離心后,得到了菌體,待預(yù)處理后使用醋酸鈉緩沖液為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為檢測方法精準(zhǔn)。在鈷胺素類物質(zhì)檢測中使用HPLC,優(yōu)勢(shì)顯著,準(zhǔn)確、快速,具有良好的重復(fù)性。因此,該方法可用于鈷胺素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。在實(shí)踐過程中,可以對(duì)維生素B12進(jìn)行定量分析,其應(yīng)用價(jià)值顯著,值得推廣。

    維生素B12為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物,在提取時(shí)關(guān)鍵環(huán)節(jié)便是破碎細(xì)胞,其對(duì)產(chǎn)物有直接的影響,比如活性、收率、成本等。因此,在實(shí)踐過程中,應(yīng)確保細(xì)胞破碎方法具有合理性、針對(duì)性和有效性。目前,常見的細(xì)胞破碎方法有2種,一種為機(jī)械法,另一種為非機(jī)械法,前者包括株磨法、超聲波法,后者包括化學(xué)法、物理法等。為了指導(dǎo)實(shí)踐,使維生素B12提取更加簡便,本文對(duì)比了不同提取方法,取得了良好的效果。其中,微波加熱法的提取時(shí)間最短,但是,在工業(yè)應(yīng)用中,需要借助大型配套設(shè)備。此外,煮沸法優(yōu)點(diǎn)顯著,提取效率高,處理量大,僅需簡單的設(shè)備,值得推廣。

    參考文獻(xiàn)

    [1]王澤建,趙琳琳,儲(chǔ)炬,等.脫氮假單胞菌生產(chǎn)維生素B12過程中糞卟啉Ⅲ的測定及發(fā)酵調(diào)控[J].中國生物工程雜志,2011,14(08):47-53.

    [2]李志春,郭海蓉,麻少瑩,等.甘蔗糖蜜發(fā)酵液中維生素B12提取方法的比較[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,10(07):1710-1713.

    〔編輯:白潔〕

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