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    蘇姜豬A-FABP基因遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

    2017-03-29 03:02:31朱愛文倪黎剛周春寶朱淑斌卞桂華
    中國畜牧雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)含子多態(tài)肉質(zhì)

    朱愛文,倪黎剛,周春寶,朱淑斌,卞桂華

    (江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

    蘇姜豬A-FABP基因遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

    朱愛文,倪黎剛,周春寶*,朱淑斌,卞桂華

    (江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

    研究采用PCR- RFLP技術(shù)分析蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬群體A-FABP基因遺傳多態(tài)性,并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析基因座多態(tài)與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明:3個(gè)豬種A-FABP基因內(nèi)含子1均具有Bsm I酶切多態(tài)性,分別檢測到3種基因型(AA、AB和BB),χ2適合性檢驗(yàn)顯示,3個(gè)豬種A-FABP基因型分布處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。多態(tài)信息含量(PIC)分析顯示,3個(gè)品種豬均為中度多態(tài);基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析顯示,不同基因型肌內(nèi)脂肪含量、大理石紋差異顯著,大理石紋AA、AB型顯著高于BB型(P<0.05),肌內(nèi)脂肪含量AA顯著高于AB、BB型(P<0.05)。結(jié)論顯示,蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬A -FABP基因intron 1多態(tài)性對肉質(zhì)性狀影響顯著。

    蘇姜豬;A-FABP基因;PCR-RFLP;肉質(zhì)性狀

    哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(Adipocyte Fatty Acid-binding Protein,A-FABP)主要在脂肪細(xì)胞中參與甘油三酯生成,以增加肌內(nèi)脂肪(Intramuscular Fat, IMF)含量。研究證實(shí),IMF和肉質(zhì)呈正相關(guān),影響肉的嫩度、風(fēng)味和多汁性,肉品2.5%~3%的肌內(nèi)脂肪含量可獲得理想口感[1]。利用分子生物學(xué)的手段——分子標(biāo)記輔助選育(MAS)去尋找控制IMF的基因,并進(jìn)行品種選育,以期提高肌內(nèi)脂肪含量,是改善肉質(zhì)行之有效的方法。

    Brockmann等[2]研究發(fā)現(xiàn),A-FABP基因位于含有影響脂肪性狀QTL的豬4號染色體上,在脂肪細(xì)胞中表達(dá),影響甘油三酯的生成與分解。Gerbens等[3]克隆、測序發(fā)現(xiàn),豬A-FABP基因全長8 144 bp,核苷酸序列包括2 370 bp 的5′-上游區(qū)域和1 435 bp的3′-下游區(qū)域;含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,4個(gè)外顯子分別編碼24、58、34、16個(gè)氨基酸,內(nèi)含子的大小為2 629、840、471 bp,與人、小鼠及大鼠同源性分別為90%、83%、81%。Gerbens等[4]研究表明,杜洛克豬A-FABP多態(tài)性與含量IMF存在相關(guān)。

    本研究以姜曲海豬、蘇姜豬(以杜洛克豬、姜曲海豬、楓涇豬為親本,經(jīng)7個(gè)世代選育,2013年9月經(jīng)國家畜禽遺傳委員會(huì)審定為豬新品種)、長白豬為研究對象,采用PCR-RFLP技術(shù)對改善豬肉質(zhì)性狀起重要作用的A-FABP基因進(jìn)行檢測、分析,旨在尋找與蘇姜豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記,探索改善蘇姜豬肉質(zhì)性狀的有效途徑,并為蘇姜豬種質(zhì)資源特性及分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)研究提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 蘇姜豬220頭、姜曲海豬96頭、長白豬144頭,分別來自姜曲海豬保種場、常州康樂農(nóng)牧公司。取以上豬種耳組織樣約0.5 g/頭,置于預(yù)置70%乙醇的1.5 mL Eppendorf管,-20℃凍存?zhèn)溆?。屠宰不同基因型?shí)驗(yàn)豬只,背最長肌中段最后肋與第一、二腰椎間中心部位取樣,測定肉質(zhì)性狀指標(biāo)。

    1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、DL-2000 Marker、dNTPs、Bsm I限制性內(nèi)切酶等,分別購自寶生物(大連)工程有限公司、上海生工生物技術(shù)有限公司、賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA提取 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA,溶于TE緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8.0)],4℃保存[5]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測抽提基因組DNA質(zhì)量。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)和 PCR擴(kuò)增體系 PCR引物根據(jù)GenBank發(fā)布的豬A-FABP基因DNA序列(登錄號:Y16039),參考朱弘焱等[6]發(fā)表的引物設(shè)計(jì),由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片段大小為783 bp。引物序列見表1。

    基因型頻率=基因型個(gè)體數(shù)/測定群體總數(shù)。χ2適合性檢驗(yàn)法分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)?;蚣兒隙?、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量采用PopGene 32統(tǒng)計(jì)軟件分析。基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性采用 SPSS(16.0版本)的GLM進(jìn)行最小二乘方差分析,比較不同基因型之間肉質(zhì)性狀差異,統(tǒng)計(jì)模型:

    其中,Yijklm為IMF測量值,μ為群體平均值,Ai為場效應(yīng),Bj品種效應(yīng),Ck為年齡效應(yīng),Dl為性別效應(yīng),Rm

    為基因型效應(yīng),eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR擴(kuò)增 所設(shè)引物用于 PCR 擴(kuò)增,結(jié)果獲得了特異性很好的產(chǎn)物(圖1),用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,片段長度與預(yù)期大小一致為783 bp,無非特異性擴(kuò)增條帶,可直接用于RFLP分析。

    表1 PCR擴(kuò)增的引物序列

    PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL:100 ng/μL DNA模板1.0 μL;10×PCR緩沖液2.0 μL;10 μmol/L引物1.0 μL; dNTPs終濃度為200 μmol/L;TaqDNA聚合酶1.0 U;其余用高壓滅菌ddH2O補(bǔ)齊。所設(shè)計(jì)引物的 PCR擴(kuò)增條件:95℃ 預(yù)變性10 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸60 s ,共32個(gè)循環(huán),72℃后延伸10 min ,4℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.2.3 RFLP分析 用BsmI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。酶切體系20 μL:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL,10×Buffer 1 μL,限制性內(nèi)切酶1 μL,滅菌蒸餾水3 μL,37℃ 反應(yīng)6~8 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析,凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

    1.2.4 肉質(zhì)性狀測定 測定主要指標(biāo)包括肉色、大理石紋、pH、失水率、剪切力和IMF含量等。用索氏抽提法提取IMF。測定方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]。

    1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 基因頻率計(jì)算公式:

    其中,p是等位基因A的基因頻率,q是等位基因B的基因頻率,nAA、nAB、nBB分別是群體中基因型AA、AB和BB型的個(gè)體數(shù)。

    圖1 豬A-FABP基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

    2.2 RFLP 檢測 對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BsmIRFLP分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),引物擴(kuò)增的目的片段存在多態(tài)性,出現(xiàn)3種基因型(圖2)。

    圖2 豬A-FABP基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物BsmI-RFLP 分析

    2.3 不同豬品種A-FABP基因遺傳多態(tài)性分析

    2.3.1 等位基因頻率和基因型頻率 對3個(gè)豬種

    A-FABP基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因型檢測,計(jì)算3個(gè)豬品種的等位基因頻率和基因型頻率。表2中χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,A-FABP基因PCR產(chǎn)物在3個(gè)豬種中基因型分布處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

    2.3.2 群體遺傳雜合度、純合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量分析 PIC用于對標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì),是表示DNA變異程度高低的指標(biāo)。PIC<0.25為低度多態(tài),0.25<PIC<0.50為中度多態(tài),PIC >0.50為高度多態(tài)。He是衡量群體內(nèi)遺傳變異的有效指標(biāo)。He越大,群體內(nèi)遺傳變異程度越大。由表3可知,3個(gè)豬種均表現(xiàn)為中度多態(tài);蘇姜豬遺傳多樣性比姜曲海豬高。

    3 討 論

    3.1 豬A-FABP基因多態(tài)性 于小燕等[9]研究發(fā)現(xiàn),松遼黑豬群體存在A-FABP基因5′UTR區(qū)域位點(diǎn)多態(tài)性,測得3種基因型;李禎等[10]利用微衛(wèi)星技術(shù)研究分析11個(gè)豬種A-FABP基因的遺傳變異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星基因座位點(diǎn)高度多態(tài);姜延志等[11]利用PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)檢測中國地方豬種雅南豬、大河豬、大河烏豬,研究發(fā)現(xiàn)A-FABP基因內(nèi)含子 1區(qū)域BsmI酶切位點(diǎn)具有多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)2個(gè)等位基因,3種基因型;張保軍等[12]在8個(gè)豬種的A-FABP基因內(nèi)含子1的微衛(wèi)星位點(diǎn)上,發(fā)現(xiàn)16個(gè)等位基因,9種基因型。郭瑞等[13]研究豬A-FABP基因的多態(tài)性及其與背膘厚的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)民豬、長白豬等群體T65A位點(diǎn)的基因型和基因頻率分布存在顯著差異,突變位點(diǎn)對背膘厚存在顯著的影響,背膘厚度AA型豬顯著低于AB型。朱淑斌等[14]研究發(fā)現(xiàn),地方豬種姜曲海豬在BsmI-RFLP位點(diǎn)上存在多態(tài)性。本研究在蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬3個(gè)豬種均發(fā)現(xiàn)BsmI-RFLP多態(tài)性,測得2個(gè)等位基因,3種基因型,與姜延志等[11]、朱淑斌等[14]結(jié)果相同。

    表2 A-FABP基因在 3個(gè)豬品種中的等位基因頻率和基因型頻率

    表3 A-FABP基因多態(tài)位點(diǎn)純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量

    2.4 不同豬種A-FABP基因酶切不同基因型對肉質(zhì)性狀的影響 由表4可知,蘇姜豬、姜曲海豬和長白豬A-FABP基因內(nèi)含子1BsmI酶切后,3種基因型對大理石紋和IMF含量均有顯著影響(P<0.05),大理石紋為AA型和AB型均顯著高于BB型(P<0.05),AA型和AB型之間差異不顯著(P>0.05);IMF含量為AA型顯著高于AB型和BB型(P<0.05)),AB型和BB型差異不顯著(P>0.05);其他肉質(zhì)性狀的不同基因型之間差異均不顯著(P>0.05)。

    表4 A-FABP基因不同酶切基因型肉質(zhì)性狀比較

    3.2A-FABP基因與豬肉質(zhì)性狀的關(guān)系 許多學(xué)者對豬A-FABP基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析研究。Andersson等[15]認(rèn)為在野豬與大白豬雜交F2代群體中第4號染色體上存在影響脂肪沉積的QTL,與Walling等[16]對梅山豬與大白豬雜交F2代群體研究結(jié)論相似。姜延志等[9]研究發(fā)現(xiàn),地方豬種大河豬、雅南豬等豬種A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域存在BsmI位點(diǎn)多態(tài)性,IMF含量AA基因型個(gè)體極顯著高于AB、BB型。Gerbens等[4]在豬A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)內(nèi)檢測到一個(gè)(CA)n微衛(wèi)星序列,杜洛克群體分析發(fā)現(xiàn)6種基因型,且AlA3較AlAl基因型IMF含量顯著提高。王存芳等[17]研究表明,杜洛克、漢普夏、長白豬、大約克和萊蕪豬A-FABP基因微衛(wèi)星(CA)n位點(diǎn)與IMF含量密切相關(guān)。于小燕等[7]在松遼黑豬群體中發(fā)現(xiàn)A-FABP基因內(nèi)含子1位點(diǎn)多態(tài)性,不同基因型對大理石紋、IMF含量有極顯著影響,而對其他肉質(zhì)性狀影響不顯著。本研究中,3 個(gè)豬種不同A-FABP基因型在大理石紋和IMF含量2個(gè)肉質(zhì)性狀指標(biāo)中存在顯著差異,最小二乘均值關(guān)系為AA > AB> BB,試驗(yàn)結(jié)果與姜延志等[11]、于小燕等[9]相似。

    3.3A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域BsmI位點(diǎn)AA基因型遺傳力 經(jīng)過對7窩89頭仔豬的實(shí)驗(yàn)室檢測,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)豬場生產(chǎn)數(shù)據(jù)資料,發(fā)現(xiàn)蘇姜豬A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域BsmI多態(tài)位點(diǎn)AA基因型公豬和AA基因型母豬交配,后代仔豬均為AA型,暫未出現(xiàn)分離或突變現(xiàn)象,該結(jié)果可能與檢測樣品數(shù)量偏少有關(guān),是否會(huì)出現(xiàn)分離或變異需進(jìn)一步檢測、研究。

    4 結(jié) 論

    本研究結(jié)果表明,蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬3個(gè)豬種A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域存在BsmI位點(diǎn)多態(tài)性,檢測到2個(gè)等位基因,3種基因型(AA、AB、BB),A為優(yōu)勢等位基因。不同基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),不同基因型大理石紋和IMF含量差異顯著,大理石紋最小二乘均值關(guān)系為AA、AB型顯著高于BB型,IMF含量最小二乘均值關(guān)系為AA型顯著高于AB、BB型,其他肉質(zhì)性狀的不同基因型差異均不顯著。筆者認(rèn)為,該突變位點(diǎn)值得引起關(guān)注,最終定論還需要擴(kuò)大樣本數(shù)、增加豬品種數(shù)、對標(biāo)記與肉質(zhì)性能關(guān)聯(lián)作進(jìn)一步深入的研究。

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    Genetic Polymorphism of A-FABP Gene and Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Sujiang Swine

    ZHU Ai-wen, NⅠ Li-gang, ZHOU Chun-bao*, ZHU Shu-bin, BⅠAN Gui-hua
    (Jiangsu Agri-animal Husbandry vocation College, Jiangsu Taizhou 225300, China)

    Aesearch by PCR-RFLP technical analyzed Sujiang swine, Jingquhai swine and landrace groups’A-FABPgenetic polymorphisms, and analyzed the correlation between loci polymorphism and meat quality traits. Results showed that the three swine-breeds’ A - FABP gene intron 1 haveBsmⅠenzyme polymorphisms, three genotypes were detected (AA, AB, and BB). The Chi-square test results showed that three swine-breeds’A-FABPgenotype distribution in Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05) .Polymorphism information content (PⅠC), which were moderately polymorphic in three varieties of swines.According to the association analysis of different genotypes of marbling and intramuscular fat content(ⅠMF), signif i cant dif f erence was found in marbling, genotype AA, AB was signif i cantly higher than BB (P<0.05), intramuscular fat content genotype AA was signif i cantly higher than AB, BB (P<0.05). Conclusion showed that Sujiang swine, Jiangquhai swine and landrace groups’A-FABPgene intron 1 polymorphism had signif i cant ef f ects on meat quality traits.

    Sujiang swine;A-FABPgene; PCR-RFLP; Meat quality traits

    S828.2

    A

    10.19556/j.0258-7033.2017-03-029

    2016-07-25;

    2016-08-08

    江蘇省科技項(xiàng)目(BY2014124);江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目(SXGC[2014]271);江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015A083)

    朱愛文(1972-),男,碩士,講師,主要從事動(dòng)物遺傳育種研究,E-mail:ZAW_0@163.com

    * 通訊作者:周春寶(1973-),男,博士,教授,主要從事動(dòng)物遺傳育種研究,E-mial:zhou_tz@ 163.com

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