抗腎纖維化藥物高內(nèi)涵篩選模型的建立及應(yīng)用

孫雪嬌，劉 祎，李 城，王曦廷，吳清華，張宇欣，栗世鈾，李亞?wèn)|，李 彧

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.中藥學(xué)院，北京 100029；3.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101)

抗腎纖維化藥物高內(nèi)涵篩選模型的建立及應(yīng)用

孫雪嬌1，劉 祎1，李 城1，王曦廷1，吳清華3，張宇欣2，栗世鈾3，李亞?wèn)|1，李 彧1

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.中藥學(xué)院，北京 100029；3.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101)

目的 建立可用于高內(nèi)涵分析的腎纖維化體外的細(xì)胞模型，為抗腎纖維化中藥化合物的篩選和機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。方法 本研究通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)正常大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK49F，以肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)作為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)對(duì)α-SMA熒光表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)細(xì)胞種板密度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)培養(yǎng)基中血清濃度等各種條件進(jìn)行優(yōu)化，建立穩(wěn)定的腎纖維化體外模型。在此基礎(chǔ)上以TGF-β1受體阻滯劑SB525334和姜黃素、大黃素對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。并進(jìn)一步探討吡非尼酮是否具有抗腎纖維化功效。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)細(xì)胞密度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基中血清濃度進(jìn)行優(yōu)化，確立了可用于高內(nèi)涵分析的NRK49F腎纖維化體外模型的建立條件。SB525334、姜黃素、大黃素和吡非尼酮均能減少TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA過(guò)表達(dá)，抑制NRK49F的活化。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)建立了可用于高內(nèi)涵篩選技術(shù)的腎纖維化體外模型，并能相對(duì)穩(wěn)定地篩選具有抗腎纖維化作用的藥物。吡非尼酮在本模型中抑制了成纖維化細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提示其可能具有抗腎纖維化作用，為抗腎纖維化藥物初篩對(duì)象的選擇提供了思路。

腎纖維化；細(xì)胞模型；高內(nèi)涵分析技術(shù)；NRK49F；α-SMA；中藥化合物

腎纖維化是各種原因引起的慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)進(jìn)展至終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的共同病理特征，包括腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，以大量的細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎臟正常的生理結(jié)構(gòu)和功能破壞為特征，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未發(fā)現(xiàn)行之有效的治療方法，僅能依靠透析或者腎移植維持生命，給患者及其家屬帶來(lái)極大的痛苦[1]。同時(shí)，近年來(lái)CKD的發(fā)病率逐年升高[2-3]。因此，進(jìn)行有關(guān)抗腎纖維化藥物的研發(fā)，對(duì)于臨床腎纖維化的預(yù)防及治療具有重大意義。

研究證明很多中藥化合物顯示出了抗腎纖維化的作用[4-5]。但是中藥或天然藥物成分復(fù)雜、種類繁多，需要建立高效快速的的篩選模型，同時(shí)基于動(dòng)物保護(hù)的原則，為了減少大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，也需要建立體外腎纖維化細(xì)胞模型。高內(nèi)涵分析(high-content analysis，HCA)是一種以細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)顯微成像法對(duì)細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的指標(biāo)信號(hào)進(jìn)行采集并通過(guò)分析圖像中的信息來(lái)解析細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)活動(dòng)的技術(shù)[6]。HCA技術(shù)可在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，在單一實(shí)驗(yàn)中可以獲得大量細(xì)胞信息以及候選藥物藥理學(xué)活性及潛在的作用機(jī)制等方面的相關(guān)信息[7]。在現(xiàn)代藥物研發(fā)中，無(wú)論是藥物的初級(jí)篩選、靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與明確、候選藥物的優(yōu)化，還是在藥物臨床前毒性和安全性的研究都具有明顯的優(yōu)勢(shì)[8-10]。與普通腎纖維化細(xì)胞模型以及傳統(tǒng)的成像分析方式相比，抗腎纖維化中藥化合物高內(nèi)涵篩選模型的建立適用于復(fù)雜中藥組分的高效率篩選及相關(guān)作用機(jī)制的研究。

本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1誘導(dǎo)正常大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK49F，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，建立了穩(wěn)定的可用于高內(nèi)涵分析技術(shù)的腎纖維化體外模型，并應(yīng)用有效藥物對(duì)模型進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常大鼠成纖維細(xì)胞(NRK49F)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清(FBS)、100 kU·L-1青霉素( penicillin)和1×105g·L-1鏈霉素(streptomycin)的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化并傳代，切勿長(zhǎng)滿。

1.2 藥物與試劑 人類重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Recombinant human TGF-β1，R&D，貨號(hào) 240B-002)，TGF-β1受體阻滯劑SB525334(selleck，貨號(hào)S1476)，鼠源α-SMA抗體(anti alpha smooth muscle actin antibody produced in mouse，Sigma，貨號(hào)A5228-200UL)，熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG(anti-mouse IgG(whole molecule) FITC antibody produced in goat，Thermo，貨號(hào)35502)，染核試劑Hoechst 33342(20 g·L-1，Sigma，貨號(hào)B2261),4%多聚甲醛溶液(PFA),5% BSA的PBS溶液，PBS緩沖液，DMEM(Gibco，貨號(hào)11995065)。TritonX -100(Sigma，貨號(hào)T8787-100 mL)。吡非尼酮(TCI,貨號(hào)P1871)，姜黃素(源葉生物，b20614-20mg)、大黃素(源葉生物，b20240-20mg)溶于DMSO中。96孔板(Grenier，貨號(hào)655090)。

1.3 儀器設(shè)備 高內(nèi)涵成像及分析設(shè)備(Molecule Device，型號(hào)ImageXpess XLS)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher scientific，型號(hào)3111)，超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司,型號(hào)ZHJH-C1115B)。

2 方法

2.1 NRK49F腎纖維化高內(nèi)涵分析體外模型的建立 按上述細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行NRK49F細(xì)胞的培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)后并接種于96孔板，種板密度分別為：每孔6 000個(gè)、8 000個(gè)、10 000個(gè)、12 000個(gè)、15 000個(gè)、20 000個(gè)、25 000個(gè)。分別設(shè)置為空白對(duì)照組和模型組，24 h后換成無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM，饑餓24 h后，空白對(duì)照組換成含有不同濃度FBS的DMEM培養(yǎng)基，模型組的培養(yǎng)液為相應(yīng)空白對(duì)照組的培養(yǎng)液中加入TGF-β1并使其終濃度為10 μg·L-1，孵育條件：5% CO2，37℃。誘導(dǎo)時(shí)間分別為：24、48、72 h。

Fig 1 Effect of serum concentration on expression of α-SMA in NRK49F cells

A：Fluorescence images of α-SMA in NRK49F cells (Blue indicating cell nucleus,green indicating α-SMA); B:Expression of α-SMA induced by TGF-β1 with or without serum;C:Effect of different serum concentrations on expression of α-SMA induced by TGF-β1 (cell density:6000 cells/well). TGF-β1 induced groupvscorresponding normal control group,*P<0.05，**P<0.01.

誘導(dǎo)結(jié)束后，用預(yù)熱至37℃的4% PFA將細(xì)胞固定20 min，PBS洗3遍，0.1% Triton X -100進(jìn)行透化30 min，5% BSA封閉并保存于4℃過(guò)夜。然后分別孵育α-SMA的一抗(1 ∶500)1 h、羊抗鼠二抗(1 ∶1 000)1.5 h、Hoechst33342(1 ∶1 000)15 min。利用高內(nèi)涵成像設(shè)備曝光照相，獲取α-SMA的相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行對(duì)比分析，將空白對(duì)照組與模型組之間差異最大的作為模型建立的最佳條件，并在待定的模型建立條件下重復(fù)3次，若結(jié)果能夠保持穩(wěn)定則確定為模型建立的條件。

2.2 NRK49F體外腎纖維化模型的驗(yàn)證 按照以上實(shí)驗(yàn)確定的模型誘導(dǎo)條件進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照組、模型組、藥物干預(yù)組，藥物干預(yù)組在加入TGF-β1的同時(shí)按不同濃度加入姜黃素(30、10、3.3、1.1 μmol·L-1)和大黃素(36,12,4,1.3 μmol·L-1)，待誘導(dǎo)時(shí)間結(jié)束，重復(fù)上述方法進(jìn)行α-SMA的檢測(cè)與分析，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 吡非尼酮抗腎纖維化作用的初步探討 在實(shí)驗(yàn)確定的模型誘導(dǎo)條件下，以治療肺纖維化臨床有效藥物吡非尼酮(1.1、0.37、0.12、0.04 mmol·L-1)作為待測(cè)藥物，按照上述實(shí)驗(yàn)方法分析檢測(cè)NRK49F細(xì)胞α-SMA的表達(dá)情況，進(jìn)行初步的藥效評(píng)定，探討吡非尼酮是否具有抗腎纖維化作用。

3 結(jié)果

NRK49F腎纖維化體外模型建立條件的優(yōu)化。

3.1 培養(yǎng)基中血清濃度的優(yōu)化 根據(jù)圖像以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果(Fig 1)，我們發(fā)現(xiàn)：在不同濃度血清的條件下，TGF-β1誘導(dǎo)后NRK49F細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)量增高且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，細(xì)胞的體積明顯變大，并由短梭形轉(zhuǎn)化長(zhǎng)梭形，具備肌成纖維細(xì)胞的特征。

當(dāng)TGF-β1(10 μg·L-1)誘導(dǎo)時(shí)間為48 h，在每孔15 000個(gè)、20 000個(gè)、25 000個(gè)的細(xì)胞種板密度條件下(Fig 1)，有血清的實(shí)驗(yàn)組(Fig 1B)中模型組較空白對(duì)照組α-SMA的表達(dá)量有明顯差異，而無(wú)血清組中模型組與空白對(duì)照組α-SMA的表達(dá)量無(wú)差異，表明NRK49F細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并高表達(dá)α-SMA需要血清。且隨著血清濃度的增加，α-SMA的表達(dá)量明顯增加(見(jiàn)Fig 1C)，呈現(xiàn)FBS劑量依賴性。

Fig 2 Effect of different induction time onexpression of α -SMA induced by TGF- β1

TGF-β1 induced groupvsthe corresponding normal control group,*P<0.05，**P<0.01.

Fig 3 Effect of different cell density on expression of α-SMA induced by TGF-β1

TGF-β1 induced groupvsthe corresponding normal control group,*P<0.05，**P<0.01. 6,8,10,12,15 k in the chart stand for 6 000 cells/well, 8 000 cells/well，10 000 cells/well, 12 000 cells/well, 15 000 cells/well.

3.2 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 為了對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，我們首先設(shè)置了種板密度為每孔6 000個(gè)、8 000個(gè)、10 000個(gè),12 000個(gè)、15 000個(gè)、20 000個(gè)、25 000個(gè)，分別誘導(dǎo)24、48 h的實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)對(duì)α-SMA表達(dá)量的分析，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為24 h時(shí)，模型組與空白對(duì)照組的α-SMA的表達(dá)量幾乎沒(méi)有明顯差異，TGF-β1的誘導(dǎo)作用尚未顯現(xiàn)。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為48 h、種板密度為15 000個(gè)/孔時(shí)，空白對(duì)照組與模型組的差異最大。隨后又增加了不同細(xì)胞種板密度下誘導(dǎo)時(shí)間為72 h的實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間分別為24、48、72 h不同組別的之間的分析比較，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為72 h時(shí)，種板細(xì)胞密度為6 000個(gè)/孔實(shí)驗(yàn)條件下的空白對(duì)照組與模型組α-SMA表達(dá)強(qiáng)度差異較大，見(jiàn)Fig 2。

3.3 細(xì)胞種板密度的優(yōu)化 NRK49F細(xì)胞種板密度不同，空白對(duì)照組與TGF-β1誘導(dǎo)的模型組α-SMA表達(dá)差異不同，當(dāng)種板細(xì)胞密度為6 000個(gè)/孔到15 000個(gè)/孔時(shí)(Fig 3)，隨著種板密度的增加，這種差異逐漸減小，當(dāng)種板細(xì)胞密度為6 000個(gè)/孔時(shí)α-SMA表達(dá)差異相對(duì)最大。

由此，我們確定了腎纖維化體外高內(nèi)涵分析模型的最佳條件，即細(xì)胞種板密度為6 000個(gè)/孔、TGF-β1(10 μg·L-1)溶于含有血清的DMEM中所構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)液、誘導(dǎo)時(shí)間為72 h。

3.4 NRK49F體外腎纖維化模型的驗(yàn)證 在通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確立的優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，我們運(yùn)用TGF-β1受體阻滯劑SB525334，文獻(xiàn)中報(bào)道的具有抗腎纖維化功效的姜黃素、大黃素對(duì)模型進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，結(jié)果如下：

根據(jù)圖像及數(shù)據(jù)分析結(jié)果(Fig 4～6)，TGF-β1受體阻滯劑SB525334、姜黃素、大黃素均能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA過(guò)表達(dá)(姜黃素P<0.05，SB525334和大黃素P<0.01)，同時(shí)能夠抑制NRK49F細(xì)胞的增殖(P<0.01)。表明文獻(xiàn)中報(bào)道的具有抗腎纖維化的化合物能夠在本模型中顯示出抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞激活的作用。

Fig 4 Effect of TGF-β1 receptor blocker SB525334 on expression of α-SMA

Fluorescence image(A)，ratio of cyto α-SMA fluorescence intensity(B) and changes of NRK49F cell number(C).*P<0.05，**P<0.01vsTGF-β1 induced model group.

Fig 5 Effect of curcumin on expression of α-SMA

Ratio of cyto α-SMA fluorescence intensity(A) and changes of NRK49F cell number(B).*P<0.05，**P<0.01vsTGF-β1 induced model group.

3.5 吡非尼酮抗腎纖維化作用的初步探討 吡非尼酮是用于肺纖維化治療的臨床用藥。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，吡非尼酮拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA的過(guò)表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)也顯示出抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的功效(P<0.01)，提示其可能具有抗腎纖維化的作用。此前吡非尼酮在抗腎纖維化方面研究相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。

4 討論

在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts)被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的主要來(lái)源，而表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)常作為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志[11]。肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于組織局部存在的成纖維細(xì)胞、骨髓來(lái)源的成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞，其中50%源自局部間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖、35%源自骨髓來(lái)源的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、10%內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition，EnMT)以及5%上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)[12-13]。為什么上述細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化成表達(dá)α-SMA、能夠產(chǎn)生大量ECM的肌成纖維細(xì)胞？其中一個(gè)關(guān)鍵的因素是由于細(xì)胞因子TGF-β1的刺激。當(dāng)器官受到損傷時(shí)，受損的細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生大量的TGF-β1，TGF-β1繼而誘導(dǎo)周圍的細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、大量增殖，引起肌成纖維細(xì)胞的聚集，成為器官纖維化重要的病理機(jī)制[14-15]。中醫(yī)藥在腎纖維化相關(guān)疾病的治療中具有良好的前景。然而中藥化合物成分繁多、種類復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)抗腎纖維化功效化合物的高效快速篩選需要建立相應(yīng)的腎纖維化體外模型。本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1誘導(dǎo)NRK49F細(xì)胞轉(zhuǎn)化，用帶有熒光的二抗對(duì)α-SMA進(jìn)行標(biāo)記，高內(nèi)涵分析技術(shù)能夠高靈敏地對(duì)相應(yīng)熒光信息進(jìn)行采集，熒光強(qiáng)度間接地反映出了α-SMA表達(dá)情況，并作為模型建立成功的檢測(cè)指標(biāo)。

Fig 6 Effect of emodin on expression of α-SMA

Ratio of cyto α-SMA fluorescence intensity(A) and changes of NRK49F cell number(B).**P<0.01vsTGF-β1 induced model group.

Fig 7 Effect of pirfenidone on expression of α-SMA

Ratio of cyto α-SMA fluorescence intensity(A) and changes of NRK49F cell number(B).*P<0.05，**P<0.01vsTGF-β1 induced model group.

由于血清中含有復(fù)雜的細(xì)胞因子，對(duì)于模型誘導(dǎo)中的細(xì)胞狀態(tài)以及TGF-β1的誘導(dǎo)作用可能產(chǎn)生干擾，另一方面，TGF-β1能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖，如果種板密度過(guò)高則TGF-β1的作用可能因細(xì)胞的接觸性抑制生長(zhǎng)而被掩蓋，同時(shí)不利于細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)熒光信息的采集，由此我們對(duì)細(xì)胞種板密度以及誘導(dǎo)過(guò)程中培養(yǎng)液血清的含量進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)在種板密度為6 000個(gè)/孔、TGF-β1(10 μg·L-1)溶于含有5% FBS的DMEM中所構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)液、誘導(dǎo)時(shí)間為72 h時(shí)，模型組較空白對(duì)照組α-SMA表達(dá)差異最大，由此確立了腎纖維化高內(nèi)涵體外模型的建立條件。

根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道，姜黃素能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖、減少ECM聚集、抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，減少TGF-β1受體的表達(dá)等[16-19]，大黃素能夠抑制腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)表達(dá)、提高基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，緩解腎纖維化[20-21]。姜黃素、大黃素以及TGF-β1受體阻滯劑SB525334在本模型中均顯示出了抑制NRK49F向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功效，驗(yàn)證了模型的相對(duì)可靠性。為進(jìn)一步利用高內(nèi)涵技術(shù)篩選抗腎纖維化藥物奠定了基礎(chǔ)。

另外，不同器官纖維化雖然病位不同，但具有共同的特征：持續(xù)的刺激不能緩解，致使局部細(xì)胞損傷，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，各種細(xì)胞因子釋放，尤其是TGF-β1，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的激活，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)并不斷沉積[22-23]。器官組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度異常沉積，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退乃至衰竭。并且有相同的細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與纖維化的發(fā)生發(fā)展，比如TGF-β/Smads通路以及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(ETM)的發(fā)生等。由于不同器官纖維化具有相同的發(fā)病機(jī)制，由此推測(cè)用于某一器官纖維化有效的藥物可能對(duì)其他器官的纖維化也有相同作用。本實(shí)驗(yàn)在成功建立腎纖維化模型的基礎(chǔ)上，對(duì)臨床上用于肺纖維化治療的藥物吡非尼酮進(jìn)行了初步檢測(cè),結(jié)果表明吡非尼酮具有抑制NRK49F激活成為肌成纖維細(xì)胞的功效，說(shuō)明其可能具有抗腎纖維化作用。這一發(fā)現(xiàn)為初步的抗腎纖維化藥物高內(nèi)涵篩選以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供了線索。

總之, 我們建立的腎纖維化細(xì)胞模型具有肌成纖維細(xì)胞特征,可用于體外篩選抗腎纖維化的藥物。

(致謝：特別感謝中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所精準(zhǔn)基因組醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室栗世鈾老師組對(duì)本課題研究的支持與幫助。)

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Establishment and application of high content screening model for anti-renal fibrosisdrugs

SUN Xue-jiao1，LIU Yi1，LI Cheng1，WANG Xi-ting1，WU Qing-hua3，ZHANG Yu-xin2，LI Shi-you3，LI Ya-dong1，LI Yu1

(1.SchoolofBasicMedicalScience；2.SchoolofChineseMedicine,Beijing100029,China；3.BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China)

Aim To establish a cellular model of renal fibrosisinvitro, which can be used for the high-content analysis, and lay a good foundation for the screening and mechanism study of traditional Chinese medicine compounds with anti-fibrotic effect.Methods In this study, normal rat kidney fibroblasts(NRK49F) were induced by TGF-β1. As the maker ofmyofibroblast, alpha smooth muscle actin(α-SMA) was detected and analyzed by high content imaging analysis system, and the cell plate density, induction time, the concentration of serum in medium were optimized, to establish a stable model of renal fibrosisinvitro. Then the model was validated by TGF- β1 receptor blocker SB525334, curcumin and emodin. On this basis，whether pirfenidone had the effect of anti-renal fibrosis was explored. Results By optimizing the cell density, induction time and serum concentration in culture medium, the conditions of NRK49F renal fibrosis modelinvitrofor high content analysis were established. SB525334, curcumin and emodin and pirfenidone reduced the expression of α-SMA in NRK49F induced by TGF-β1. Conclusions Aninvitromodel of renal fibrosis, which can be used for high content screening technology, is established and can be used to screen drugs with anti-renal fibrosis effects relatively stably. Pirfenidone in this model inhibits the transformation of NRK49F into myofibroblasts, suggesting that it may be able to inhibit renal fibrosis, providing a way for the selection of objects for anti-renal fibrosis drug screening.

renal fibrosis;cell model;high-content analysis;NRK49F;α-SMA;Chinese traditional medicine compounds

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.016.html

2016-10-13，

2016-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 81573716,No 81173642)

孫雪嬌(1990-)，女，碩士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)腎病，E-mail：1099648128@qq.com; 李 彧(1974-)，女，博士，副研究員，副教授，研究方向： 中醫(yī)藥防治器官纖維化，通訊作者，E-mail：liyubeijing1973@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.008

A

1001-1978(2017)03-0327-08

R-332；R282.71；R363-332；R692.9；R965.1