熱性中藥成分辣椒堿調(diào)節(jié)小鼠UCP1的分子機(jī)制研究

孟 晶，戴逸飛，周煒煒，李 倩，周海玉，姬海南，戴 麗，王朋倩，霍海如，隋 峰

(中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

熱性中藥成分辣椒堿調(diào)節(jié)小鼠UCP1的分子機(jī)制研究

孟 晶，戴逸飛，周煒煒，李 倩，周海玉，姬海南，戴 麗，王朋倩，霍海如，隋 峰

(中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

目的 為進(jìn)一步揭示熱性中藥的分子機(jī)制、詮釋中藥寒熱藥性理論的科學(xué)內(nèi)涵，同時對能量代謝開關(guān)解偶聯(lián)蛋白亞型1(UCP1)的表達(dá)調(diào)控作用進(jìn)行研究。方法 采用熱偶技術(shù)對小鼠的核心溫度和尾部皮膚溫度進(jìn)行了給藥后的實(shí)時監(jiān)測，溫度的采集分析采用了熱偶檢測技術(shù)，UCP1的表達(dá)量分別采用了熒光定量 PCR 和 Western blot的技術(shù)。結(jié)果 辣椒堿給藥后小鼠機(jī)體中心溫度先降低后上升，尾部皮膚溫度以升高為主,與空白對照組相比差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)；UCP1的基因和蛋白的表達(dá)量均明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 上調(diào)UCP1的表達(dá)進(jìn)而提高機(jī)體的能量代謝可能是辣椒堿作為辣椒的熱性成分表征熱性屬性的生物分子機(jī)制之一。

熱性中藥； 藥性理論；辣椒堿；能量代謝；分子機(jī)制；解偶聯(lián)蛋白

寒熱藥性是中藥的一種特殊的核心屬性，由其共性規(guī)律凝練升華而成的中藥寒熱藥性理論是中醫(yī)藥理論體系的重要組成部分，對于中醫(yī)臨床潛方用藥起著至關(guān)重要的作用。近年來, 國家科技部、國家中醫(yī)藥管理局、國家自然科學(xué)基金委等部分先后立項(xiàng)以解析中藥藥性、尤其是寒熱藥性的生物學(xué)基礎(chǔ)和分子機(jī)制，但總體看仍未取得突破性進(jìn)展。我們課題組長期從事中藥藥性理論的客觀化研究，以往研究發(fā)現(xiàn)部分熱性中藥成分可能通過激活或調(diào)節(jié)寒熱感受通道蛋白(如TRPV1等)影響機(jī)體的能量代謝過程而表征中藥的熱性屬性[1-4]。為進(jìn)一步深入解析熱性中藥基于能量代謝環(huán)節(jié)的生物學(xué)分子機(jī)制，本研究以列入2010 版中國藥典的具有辛熱藥性的溫里中藥辣椒為關(guān)注點(diǎn)，以其主要活性成分—辣椒堿 (已列入24 版和25 版《美國藥典》)為研究對象，在采用熱偶檢測分析方法評價辣椒堿對小鼠產(chǎn)熱和散熱環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上，引入了機(jī)體能量開關(guān)——解偶聯(lián)蛋白亞型1(UCP1)，分別從基因和蛋白層面深入解析辣椒堿的藥性生物分子基礎(chǔ)，挖掘中藥-物質(zhì)基礎(chǔ)-藥效-藥性之間的內(nèi)在規(guī)律性，為全面揭示中藥藥性奠定實(shí)驗(yàn)和方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器 精密溫度采集系統(tǒng)，Physitemp Instruments Inc；5402冷凍離心機(jī)Eppendorf 公司；ABI 2720 Thermal Cycle Applied Biosystem；ABI 7500熒光定量PCR儀，Applied BioSystem；HT300電泳設(shè)備，北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；5402冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司；TY-80A脫色搖床，常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠； BSA223S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；ND-8000型核酸定量儀，Gene Company Limited基因有限公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品 辣椒堿，Sigma產(chǎn)品(批號：BCBM1193)；總RNA提取試劑盒(離心柱型)(批號：04210)、QuantScript RT Kit (批號：03529)、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(批號：04128) 均購于天根生化科技有限公司；乙二胺四乙酸磷酸氫二鈉(批號：20110326)、甘氨酸(批號：20130205)、過硫酸銨(批號：20130517)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(批號：20121101)、十二烷基硫酸鈉(批號：20130625)、丙烯酰胺(批號：20130513)等均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris(三羥甲基氨基甲烷)(批號：201-064-4)購于AMERCO；RIPA裂解液(批號：47S001100)購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Coomase Brilliant Blu R-250(批號：228-0605)購于北京東勝泰博科技有限公司；Trizma base(批號：BCBD2752V)購于Sigma公司；兔抗-UCP1(批號：12J08)為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；5×蛋白上樣緩沖液(批號：140506)，購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司；蛋白marker(批號：00298242)為Thermo Scientific產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 昆明小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(20±2) g，64只，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部)，許可證號SCXK(京)2011-0012。

2 方法

2.1 小鼠機(jī)體熱學(xué)變化的檢測分析 小鼠禁食2 h，用烏拉坦麻醉(1.35 g·kg-1體重)。將檢測儀中一個探頭放置在小鼠尾根部檢測尾部皮膚溫度，另一個小鼠探頭插入肛門用以檢測小鼠機(jī)體深部核心溫度。在測試過程中，動物放置在加熱毯上維持機(jī)體溫度的相對恒定，并使環(huán)境溫度保持在30℃～32℃。辣椒堿用含80% 生理鹽水、10% Tween 80 和10% 乙醇的溶液溶解后，分別按照高(0.02 mg·g-1)、中(0.01 mg·g-1)、低(0.002 mg·g-1)劑量分組，皮下注射給藥；另設(shè)溶劑(含80% 生理鹽水、10% Tween 80 和10%乙醇)對照組，每組4只鼠，待動物肛溫與鼠尾皮膚溫度穩(wěn)定30 min后給藥。

2.2 小鼠BAT中UCP1基因表達(dá)的檢測分析 將小鼠分為辣椒堿高、中、低劑量組和對照組。每組分別給藥5 d、7 d后，小鼠斷頸處死，取出背部脂肪組織，剪切成小塊裝入EP管中備用。按照NCBI genebank 上公布的基因序列對UCP1和GAPDH引物設(shè)計(jì)后由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成，GAPDH：正向5′-CTCAGGATTGGCCTCTACGACTC-3′，反向5′-TTGGTGTACATGGACATCGCA-3′；UCP1：正向5′-GAAGGTCGGTGTGAACGGATT-3′，反向5′-GAAGACACCAGTAGACTCCACGACATA-3′。采用吸附柱吸附的方法提取總RNA。在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取出逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物取出引物和模板，置于冰上解凍。按說明書配制Real-Time PCR反應(yīng)液。蓋上反應(yīng)管，輕柔混勻，短暫離心。將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中，按Tab 1中的擴(kuò)增條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

Tab 1 Reaction parameters for Real-time PCR

本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量相對定量的方法，并以2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其計(jì)算公式如下：ΔΔCt =(Ct, Target-Ct, GAPDH)X-(Ct, Target-Ct, GAPDH)Control。X表示任意組，Control表示經(jīng)GAPDH校正后1倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。

2.3 Western 檢測小鼠BAT中UCP1蛋白的表達(dá) 小鼠的分組和給藥同“2.2”部分。把剝離下的組織用PBS清洗兩次，按每20 mg組織100 μL的比例加入裂解液，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液檢測蛋白濃度。取50 μg組織上樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下在搖床搖動封閉2 h。封閉后，用0.2% PBST洗3次。將膜放入盛有兔多克隆抗體(1 ∶200，封閉液稀釋)的自封袋中，室溫在搖床上孵育2 h，孵育后用0.2% PBST洗3次。然后將膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶2 000)中孵育2 h，孵育后用0.2% PBST洗3次。在膜上加入適量超敏ECL發(fā)光底液，放入凝膠成像系統(tǒng)中檢測。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 辣椒堿對小鼠基礎(chǔ)能量代謝的影響 如Tab 2、Fig 1所示，給藥后，小鼠的肛溫開始下降，各給藥組在60 min左右時下降的幅度與對照組相比，差異均有顯著性 (P<0.01)；而在60 min左右時，各給藥組小鼠肛溫漸漸上升，240 min左右時，各給藥組小鼠肛溫升至基礎(chǔ)水平。由Tab 3、Fig 2可見，灌胃辣椒堿后，伴隨肛溫下降，小鼠尾部皮膚溫度迅速上升，一段時間后下降，各給藥組在30 min左右時，與對照組相比，上升幅度差異有顯著性(P<0.01)。

3.2 辣椒堿對小鼠BAT中UCP1 mRNA相對表達(dá)的影響 如Tab 4、Fig 3所示，給藥5 d后，低、中和高劑量胡椒堿組UCP1 mRNA的相對表達(dá)分別增加了1.58倍、5.46倍、11.67倍，呈現(xiàn)良好的劑量依賴性，其中中劑量胡椒堿組和高劑量胡椒堿組的UCP1 mRNA的表達(dá)與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)。由Tab 5、Fig 4 可見，給藥7 d后，低、中、高胡椒堿組UCP1 mRNA的相對表達(dá)分別增加了1.22倍、1.81倍、8.22倍，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其中高劑量胡椒堿組UCP1mRNA表達(dá)與對照組相比差異均有顯著性(P<0.01)。

Fig 1 Effect of capsaicin on anus temperature of mice℃)

℃)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

℃)

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of capsaicin on tail-skin temperature℃)

Fig 3 Effect of capsaicin on expression of UCP1mRNA

**P<0.01vscontrol

GroupRelativeexpression(2-△△CT)Control1.00±0.29Low1.58±0.24Middle5.46±0.42**High11.67±1.19**

**P<0.01vscontrol

Fig 4 Effect of capsaicin on expression of UCP1mRNA

**P<0.01vscontrol

3.3 辣椒堿對小鼠BAT中UCP1蛋白表達(dá)的影響 如Fig 5 所示，小鼠灌胃辣椒堿5 d后，UCP1蛋白表達(dá)增加，呈明顯的劑量相關(guān)，其中高劑量辣椒堿組的UCP1蛋白表達(dá)與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。如Fig 6所示，小鼠灌胃辣椒堿7 d后，UCP1蛋白表達(dá)明顯增加，辣椒堿各給藥組與空白對照組相比，UCP1蛋白表達(dá)差異均有顯著性(P<0.05)。

4 討論

對于包括人在內(nèi)的恒溫動物來說，保持體溫的恒定是適應(yīng)外界環(huán)境得以生存的必要條件。正常生理狀態(tài)下，環(huán)境溫度升高時，機(jī)體通過減少產(chǎn)熱和增加散熱來維持體溫相對恒定。反之，當(dāng)環(huán)境溫度下降時，則產(chǎn)熱增加而散熱減少[5-6]。現(xiàn)已明確，機(jī)體的散熱過程主要是在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，機(jī)體內(nèi)部的體熱通過血液循環(huán)和熱傳導(dǎo)兩種方式轉(zhuǎn)移到皮膚，皮膚再通過輻射、傳導(dǎo)、對流和蒸發(fā)四種方式完成的[6-7]。其中，血管舒張會引起皮膚血管血流增加，熱量散失增多；血管收縮則導(dǎo)致皮膚血管血流量減少，熱量散失減少[8-9]。而機(jī)體的產(chǎn)熱主要包括非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱和戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱。非戰(zhàn)栗性性產(chǎn)熱代表了機(jī)體主要的產(chǎn)熱渠道，源于不同組織的新陳代謝，如受腎上腺素和甲狀腺激素調(diào)節(jié)的棕色脂肪組織，以及肝臟產(chǎn)熱等。戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱主要來自骨骼肌[10-11]。

Fig 5 Effect of capsaicin on expression of UCP1 protein

*P<0.05vscontro

Fig 6 Effect of capsaicin on expression of UCP1 protein

**P<0.01vscontrol

本研究中，我們選擇了肛溫作為機(jī)體核心溫度(core body temperature)變化的指標(biāo)，而鼠尾皮膚溫度與血管收縮和舒張引起的血流量密切相關(guān)，因而可以作為散熱量的評價指標(biāo)。兩個指標(biāo)綜合分析能夠說明藥物對小鼠能量代謝的調(diào)節(jié)作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，熱性中藥成分辣椒堿灌胃小鼠后，肛溫開始降低，而鼠尾皮膚溫度迅速升高，表明此階段機(jī)體的散熱大于產(chǎn)熱。而在大約60 min后，肛溫慢慢上升，提示此時機(jī)體的產(chǎn)熱大于散熱?，F(xiàn)已明確，在棕色脂肪組織(BAT)線粒體內(nèi)膜上高豐度表達(dá)著解偶聯(lián)蛋白-1(UCP1)[12-13]。UCP1是解偶聯(lián)蛋白(UCP)家族中主要表達(dá)在BAT細(xì)胞線粒體膜內(nèi)的重要成員之一，其主要功能是通過將呼吸鏈與ATP產(chǎn)生過程解偶聯(lián)最終將其消耗的脂肪轉(zhuǎn)化為熱量而非ATP[14-15]。

業(yè)已證實(shí)，機(jī)體在寒冷、應(yīng)激、傷害等刺激條件下，機(jī)體BAT中的UCP1表達(dá)量上調(diào)，產(chǎn)熱能力增強(qiáng)[15-16]，表明UCP1對機(jī)體能量代謝平衡的維持起著關(guān)鍵性的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，辣椒堿連續(xù)給藥5 d或7 d后，UCP1基因和蛋白表達(dá)均上調(diào)，意味著小鼠的產(chǎn)熱能力增強(qiáng)，這與試驗(yàn)中我們檢測到的小鼠給藥辣椒堿后機(jī)體的產(chǎn)熱量增加相吻合。結(jié)合我們以往的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可以認(rèn)為上調(diào)UCP1的表達(dá)進(jìn)而提高機(jī)體的能量代謝是辣椒堿作為辣椒的熱性成分表征熱性屬性的生物分子機(jī)制之一。當(dāng)然，從辣椒堿入體后小鼠的整體代謝情況看，小鼠既有體溫的下降，也出現(xiàn)了體溫逐步回升的過程；既有散熱，也有產(chǎn)熱過程，兩者均參與了辣椒堿調(diào)節(jié)機(jī)體代謝的生物學(xué)作用。但這兩個熱學(xué)變化是由辣椒堿作用于機(jī)體同一靶點(diǎn)引起的，還是作用于多個靶點(diǎn)通過不同的作用機(jī)制整合后的生物效應(yīng)，尚有待深入研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥理論與本草文獻(xiàn)研究中心實(shí)驗(yàn)室完成，由孟晶、戴逸飛、周煒煒、李倩、周海玉、姬海南、戴麗、王朋倩、霍海如、隋峰等共同參與。)

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Study on molecular mechanism of the hot-herb component capsaicin based on UCP1 regulation

MENG Jing, DAI Yi-fei, ZHOU Wei-wei, LI Qian, ZHOU Hai-yu,JI Hai-nan, DAI Li, WANG Peng-qian, HUO Hai-ru, SUI Feng

(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Aim To further uncover the molecular mechanism of hot herbs and thus to decode the scientific significance of herb nature theory, real-time check on the core body temperature and tail skin temperature of the capsaicin-administrated mice was conducted and the expression of UCP1 at the mRNA and protein levels was also performed. Methods The temperatures of the mice were registered by the heat electronic couple technique, and the expression of UCP1 was assayed by the methods real-time PCR and Western blot respectively. Results The core body temperature of the mice after administration of capsaicin decreased and then increased, while the tail skin temperature increased rapidly upon treatment with capsaicin (P<0.05 orP<0.01); both the mRNA and protein expression levels of UCP1 were up-regulated(P<0.01). Conclusion Promotion on energy metabolism though up-regulation of UCP1 may be one of the biologically molecular mechanisms for the capsaicin to demonstrate its characteristics in terms of cold-hot natures of Chinese herbs.

hot nature herbs; herb nature theory; capsaicin; energy metabolism; molecular mechanism; uncoupling protein 1

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.020.html

2016-09-14

2016-11-24

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 81274112,81373986,81473372);國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No 8143125,81403322)；北京市自然科學(xué)基金(No 7152016)

孟 晶(1992-)，女，碩士生，研究方向：中藥學(xué)，E-mail:mengyiff@163.com; 隋 峰(1967-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥管理和藥理學(xué)，E-mail:suifeng2136@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.010

A

1001-1978(2017)03-0338-05

R-332；R284.1；R285.1；R349.1；R977.6