雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)肝細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)及機(jī)制研究

虞 茜，萬(wàn)子衿，朱燕萍，徐海榮，廖 凱，劉 峰，李 巍

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225001)

雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)肝細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)及機(jī)制研究

虞 茜1,2，萬(wàn)子衿1,2，朱燕萍1,2，徐海榮1,2，廖 凱1,2，劉 峰1，李 巍1,2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225001)

目的 探索雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)對(duì)肝細(xì)胞中細(xì)胞色素P450(CYPs)的誘導(dǎo)及可能機(jī)制。方法 TP處理大鼠原代肝細(xì)胞或HepG2細(xì)胞后，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot等方法檢測(cè)CYPs的表達(dá)水平變化，并結(jié)合特異性抑制劑或基因敲低的方法分析TP誘導(dǎo)CYPs的可能機(jī)制。結(jié)果 TP能夠分別誘導(dǎo)大鼠CYP1A2、2C7、2C11、2C12、2D2、2E1和3A1的mRNA表達(dá)，50 nmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)倍數(shù)分別為18.5、2.2、31.2、3.2、21.5、88.3、34.0；100 nmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)倍數(shù)分別為20.3、4.6、29.6、23.1、61.1、83.0、38.5。HepG2細(xì)胞中人CYP1A1、2B6、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4也被TP誘導(dǎo)。大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)核受體PXR和CAR的活性被TP下調(diào)；TP可上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)p53的蛋白水平，p53活性抑制后TP對(duì)部分CYPs的誘導(dǎo)作用受到抑制。結(jié)論 TP可在肝細(xì)胞水平誘導(dǎo)CYPs表達(dá)，該誘導(dǎo)作用可能不通過核受體，p53可能參與了TP對(duì)部分CYPs的誘導(dǎo)作用。

雷公藤內(nèi)酯醇；細(xì)胞色素P450；核受體；p53；肝細(xì)胞；HepG2

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide, TP)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥雷公藤(Tripterygiumwilfordii)的主要活性物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤和免疫抑制等多種藥理活性[1]。采用大鼠的整體實(shí)驗(yàn)研究表明，TP可誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)幾種CYPs[2]。而體外肝細(xì)胞模型能否復(fù)制體內(nèi)TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用，另一重要的代謝酶亞家族CYP2D能否被誘導(dǎo)，以及TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用機(jī)制未見報(bào)道。因此，本研究對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞在TP作用后CYPs、核受體及轉(zhuǎn)錄因子p53的表達(dá)進(jìn)行了分析。此外，為考察TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用是否可能在人體發(fā)生，本研究對(duì)人源的HepG2肝癌細(xì)胞在TP作用下CYPs的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 試劑 雷公藤內(nèi)酯醇(四川維克奇生物制品有限公司，純度≥98%，溶于二甲基亞砜DMSO)，I型鼠尾膠原蛋白(生友生物技術(shù)有限公司)，膠原酶IV型(Sigma)，HBSS(+)和HBSS(-)(上海生工)，Percoll(Pharmacia)，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液(Solarbio)，7-乙基香豆素(7-EC，Sigma)，T4 Ligase(New England BioLAB)，感受態(tài)大腸桿菌(DH5α，寶生物公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Q RT SuperMix for qPCR，Vazyme)，Taqman法實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(FastStart Universal Probe Master，Roche)，Taqman探針(Life technologies)，SYBR Green法實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(FastStart Essential DNA Green Master，Roche)，鼠抗CYP3A4(Millipore)，兔抗p53(Proteintech)，兔抗CAR(Proteintech)，兔抗PXR(Proteintech)，鼠抗GAPDH(KANGCHEN)，山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，F(xiàn)luorChem E多功能成像分析系統(tǒng)(Proteinsimple公司)，熒光酶標(biāo)儀(Biotech公司)，LC/MS/MS(AB公司)，電泳系統(tǒng)(Biored公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche公司)。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量(195±15)g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)比較中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0004]。

1.4 大鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 大鼠原代肝細(xì)胞采取兩步膠原酶灌注法分離。Wistar大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的水合氯醛(ip)麻醉后暴露腹腔，門靜脈流入37 ℃灌注液(NaCl 0.142 mol·L-1、KCl 6.7 mmol·L-1、HEPES 0.01 mol·L-1、EDTA 0.05 mmol·L-1，pH=7.4，流速10 mL·min-1)，同時(shí)剪開腹靜脈。肝臟灌注至黃白色后換成膠原酶溶液[0.5 g·L-1溶于HBSS(+)，37 ℃]灌注15 min。移出肝臟用HBSS(-)清洗，于HBSS(-)中去除肝葉表面的膜并輕挑肝臟，采用200目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液至50 mL離心管中。4 ℃、126×g離心細(xì)胞懸液1 min兩次。用體積分?jǐn)?shù)為28%的Percoll重懸細(xì)胞后4 ℃、126×g離心10 min，移去上清。用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素、MEM NEAA 2 mmol·L-1、HEPES 10 mmol·L-1)重懸細(xì)胞，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液1 ∶1稀釋后細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔4×105接種于Ⅰ型鼠尾膠原蛋白包被的6孔板。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后用TP (0、50、100 nmol·L-1)處理，每12 h更換含藥培養(yǎng)基。

1.5 p53敲低的HepG2細(xì)胞的建立 由于HepG2細(xì)胞直接轉(zhuǎn)染效率較低，采用慢病毒建立p53敲低的HepG2細(xì)胞株。合成p53 shRNA編碼序列(序列在Sigma mission shRNA的基礎(chǔ)上修改所得，見Tab 1)后進(jìn)行退火反應(yīng)，形成帶有粘性末端的雙鏈序列。采用T4 Ligase將上述退火產(chǎn)物與BbsI酶切后的MSCV-puro-BbsI進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定，獲得質(zhì)粒分別命名為MSCV-puro-532和MSCV-puro-533。分別將上述構(gòu)建好的質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照MSCV-puro-SCR與pCMV-Gag-Pol 和pCMV-VSV-G(DNA含量分別為1.8、0.6、0.6 μg) 共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24 h后使用293T細(xì)胞培養(yǎng)基感染HepG2細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后更換含2 mg·L-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)72 h，之后用1 mg·L-1嘌呤霉素維持培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞命名為HepG2-532、HepG2-533和HepG2-SCR。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) TP處理大鼠原代肝細(xì)胞或HepG2細(xì)胞48 h后，TRIzol法提總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Taqman探針法檢測(cè)大鼠CYP1A2、2B1、2D2、2E1、3A1和3A9的mRNA的表達(dá)變化。SYBR Green法檢測(cè)大鼠的CYP2C6、2C7、2C12、PXR和CAR，以及人CYP1A1、2B6、2C9、2C19、2E1和3A4的mRNA的表達(dá)變化，SYBR Green引物序列見Tab 1。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 TP(0，50和100 nmol·L-1)處理大鼠原代肝細(xì)胞后，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，以50 μg上樣，電泳轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加一抗CYP3A4(1 ∶1 000)、p53(1 ∶1 000)、CAR(1 ∶1 000)、PXR(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)于4 ℃孵育過夜，洗膜后加二抗，室溫孵育1 h。ECL顯色，用FluorChem E多功能成像分析系統(tǒng)成像。

1.8 CYPs活性檢測(cè) 全CYPs活性采用7-EC檢測(cè)。大鼠原代肝細(xì)胞2×105接種于12孔板，用TP處理72 h后，更換含7-乙基香豆素的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育30 min，收集培養(yǎng)基，剩余細(xì)胞采用BCA法測(cè)蛋白濃度。培養(yǎng)基加等體積乙醇沉淀蛋白，13 000×g離心后，采用熒光酶標(biāo)儀，于350 nm下激發(fā)，檢測(cè)450 nm發(fā)射光，該結(jié)果采用每孔蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。大鼠原代肝細(xì)胞2×106接種于培養(yǎng)皿，采用TP(0、50、100 nmol·L-1)處理72 h后，細(xì)胞刮刀取全部細(xì)胞離心并用PBS清洗兩次，細(xì)胞重懸于磷酸鉀緩沖液(100 mmol·L-1，pH 7.4)中，玻璃勻漿器研磨后于9 000×g離心，所得上清為S9。睪酮(250 μmol·L-1)或丁呋洛爾(70 μmol·L-1)分別與含MgCl2(5 mmol·L-1)、NADPH(1 mmol·L-1)和S9(0.225 g·L-1)的磷酸鉀緩沖液(100 mmol·L-1，pH 7.4)于37 ℃下孵育30 min，反應(yīng)產(chǎn)物6β-羥基睪酮和1-羥基丁呋洛爾采用LC/MS/MS檢測(cè)[3]。

Tab 1 Primers used in the real-time quantitative PCR reactions and p53 shRNA

2 結(jié)果

2.1 TP誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞中CYPs的表達(dá)和活性 TP處理大鼠原代肝細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)CYPs mRNA的變化。該結(jié)果與整體實(shí)驗(yàn)的趨勢(shì)相似[2]，TP可誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)的CYP1A2、2C11、2E1、3A1的mRNA的表達(dá)，50 nmol·L-1下的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為18.5、31.2、88.3、34.0，100 nmol·L-1下的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為20.3、29.6、83.0、38.5(Fig 1A～1D)。該結(jié)果提示，大鼠原代肝細(xì)胞可能成為研究TP對(duì)CYPs誘導(dǎo)的體外模型。應(yīng)用該模型，研究發(fā)現(xiàn)CYP2C7、2C12和2D2的mRNA水平也被TP誘導(dǎo)，50 nmol·L-1下的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為2.2、3.2和21.5，100 nmol·L-1下的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為4.6、23.1和61.1(Fig 1E～1G)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TP可導(dǎo)致CYP3A的蛋白水平上調(diào)(Fig 2)，提示了蛋白上調(diào)與mRNA上調(diào)一致。

大鼠原代肝細(xì)胞在TP處理72h后，采用全CYPs底物7-EC共孵育，7-EC的生成速率明顯上調(diào)，提示TP可能誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)的CYPs活性(Fig 3A)。制備S9進(jìn)行體外代謝反應(yīng)，結(jié)果與整體實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)一致[2]，TP導(dǎo)致6β-羥基睪酮的生成速率加快(Fig 3B)，提示該體外原代肝細(xì)胞模型可作為TP對(duì)CYPs誘導(dǎo)的研究模型。由于本研究首次報(bào)道CYP2D2的mRNA水平被誘導(dǎo)，因此對(duì)TP處理大鼠原代肝細(xì)胞后的S9代謝丁呋洛爾為1-羥基丁呋洛爾的代謝速率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1-羥基丁呋洛爾的生成速率上升約1.7倍(Fig 3C)，提示TP在表達(dá)和酶活性水平均可誘導(dǎo)CYP2D2。

2.2 核受體CAR和PXR的表達(dá) 核受體是CYPs表達(dá)調(diào)控的重要分子，因此采用qRT-PCR及Western blot對(duì)TP作用后核受體CAR和PXR的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在TP作用后CAR和PXR的mRNA水平下調(diào)(Fig 4A、4B)，50 nmol·L-1TP處理下，CAR和PXR的mRNA水平分別為對(duì)照組的0.8和0.3倍，而100 nmol·L-1TP處理后分別為0.2和0.1倍，但是蛋白水平變化不明顯(Fig 2)。

Fig 1 Changes of mRNA level of CYP1A2(A),CYP2C11(B),CYP2E1(C),CYP3A1(D),CYP2C7(E),CYP2C12(F),CYP2D2(G),CYP2B1(H) and CYP3A9(I) in rat primary hepatocytes after triptolide treatment

**P<0.01vscontrol group

Fig 2 Western blot results(A) and relative band density of CYP3A(B), PXR(C), CAR(D) andp53(E) in rat primary hepatocytes after triptolide treatment

該結(jié)果提示TP可能不通過誘導(dǎo)核受體CAR和PXR而提高CYPs的表達(dá)，但由于核受體表達(dá)量的變化不能完全反映其活性，而其下游靶基因的表達(dá)水平可間接反映核受體活性。為進(jìn)一步檢測(cè)PXR與CAR的活性的可能變化，我們檢測(cè)了其下游靶基因P-糖蛋白(P-gp)的mRNA水平。結(jié)果表明，TP作用下P-gp的mRNA水平下調(diào)(Fig 4C)，在50、100 nmol·L-1的TP作用下，分別為對(duì)照組的0.6和0.4倍，提示了PXR和CAR活性水平的下調(diào)。該結(jié)果表明，TP可能不活化核受體PXR和CAR，因此核受體可能并不參與TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子p53的表達(dá) 據(jù)報(bào)道p53可能誘導(dǎo)CYPs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致CYPs活性上調(diào)[4-6]。在50、100 nmol·L-1的TP處理CYPs后，p53蛋白水平上調(diào)(Fig 2)。為進(jìn)一步檢測(cè)p53在TP調(diào)控CYPs中的作用，將p53抑制劑Pifithrin-α hydrobromide與TP共同作用于大鼠原代肝細(xì)胞后，提取總RNA并檢測(cè)CYPs的mRNA水平變化。結(jié)果顯示，100 nmol·L-1的TP對(duì)大鼠CYP1A2、2D2、2E1和3A1誘導(dǎo)倍數(shù)分別為100.5、130.6、426.4、420.0倍；加入p53抑制劑后，誘導(dǎo)倍數(shù)分別為17.2、22.3、111.1、22.0。該結(jié)果表明p53抑制后，TP對(duì)細(xì)胞內(nèi)CYP1A2、2D2、2E1和3A1的誘導(dǎo)能力降低。但p53抑制劑對(duì)TP誘導(dǎo)CYP2C7的作用無(wú)明顯影響。p53抑制劑導(dǎo)致TP對(duì)CYP2C11、2C12的誘導(dǎo)能力提高(Fig 5)，100 nmol·L-1的TP對(duì)上述兩酶的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為29.6和13.0，加入p53抑制劑后，誘導(dǎo)倍數(shù)分別為45.9和34.8。該結(jié)果提示，p53可能在TP對(duì)CYPs誘導(dǎo)作用中發(fā)揮作用。

2.4 TP誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株中CYPs表達(dá) 由于人與大鼠CYPs的誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制可能存在種屬的差異，因此本研究采用HepG2細(xì)胞以考察TP是否也可通過p53信號(hào)途徑誘導(dǎo)CYPs的表達(dá)。在HepG2-SCR 細(xì)胞中，50 nmol·L-1TP誘導(dǎo)CYP1A1、2B6、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4的mRNA表達(dá)，分別為48.0、20.8、114.0、67.8、36.4、6.2和21.0倍。因?yàn)镠epG2細(xì)胞中核受體PXR和CAR表達(dá)極低或缺失[8-9]，該結(jié)果提示在人源肝細(xì)胞模型中，TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用可能也可不通過這兩個(gè)核受體。在p53敲低的HepG2-532和HepG2-533細(xì)胞中，CYP2C9和CYP3A4的誘導(dǎo)在兩株細(xì)胞中均被抑制(Fig 6)，提示TP在HepG2細(xì)胞中對(duì)這兩個(gè)酶的誘導(dǎo)作用可能通過p53。

Fig 3 Changes of metabolic rate of 7-EC(A),testosterone(B) and bufuralol(C) in rat primary hepatocytes after triptolide treatment

**P<0.01vscontrol group

3 討論

前期研究表明，TP灌胃后大鼠肝內(nèi)的CYP1A2、2C11、2E1、3A1可被誘導(dǎo)[2]。但體內(nèi)CYPs的調(diào)控可能是復(fù)雜的過程，其表達(dá)可能與體內(nèi)的微環(huán)境變化相關(guān)，包括內(nèi)源性的氧化類固醇、膽汁酸、雄激素、孕激素、腎上腺素和炎癥因子等。為進(jìn)一步確認(rèn)TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用是否可在肝細(xì)胞水平上發(fā)生或依賴于體內(nèi)環(huán)境的變化，本研究采用大鼠原代肝細(xì)胞對(duì)TP的誘導(dǎo)作用進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)CYP1A2、2C11、2E1、3A1的表達(dá)均被TP誘導(dǎo)，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此本研究結(jié)果提示，大鼠原代肝細(xì)胞可成為TP對(duì)CYPs誘導(dǎo)研究的體外模型。應(yīng)用大鼠原代肝細(xì)胞的模型，本研究發(fā)現(xiàn)TP也可誘導(dǎo)CYP2C7、2C12、2D2的表達(dá)。應(yīng)用HepG2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TP可誘導(dǎo)人CYP1A1、2B6、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4的表達(dá)。結(jié)果表明，TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用可發(fā)生在肝細(xì)胞水平，大鼠原代肝細(xì)胞和人HepG2細(xì)胞均可成為研究TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)機(jī)制的體外模型。

Fig 4 Changes of mRNA level of CAR(A),PXR(B) and P-gp(C) in rat primary hepatocytes after triptolide treatment

**P<0.01vscontrol group

Fig 5 Changes of mRNA level of CYP1A2, CYP2D2, CYP2E1, CYP3A1, CYP2C7, CYP2C11 and CYP2C12 when rat primaryhepatocytes were co-treated with triptolide(100 nmol·L-1) andp53 inhibitor(pifithrin-α hydrobromide, 20 μmol·L-1)

**P<0.01vsDMSO group

Fig 6 Changes of mRNA level of CYP1A1, CYP2B6, CYP2C9,CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 inHepG2-SCR, HepG2-532 and HepG2-533 cellsafter 50 nmol·L-1 triptolide treatment

**P<0.01vsHepG2-SCR group

據(jù)報(bào)道，TP能夠被人和大鼠體內(nèi)CYP3A代謝為低毒的羥基化產(chǎn)物[7]，并可能抑制CYPs的活性，提示TP與其他藥物共服可能誘導(dǎo)藥藥相互作用(DDI)。但值得注意的是，TP對(duì)CYP1A2和CYP3A4的IC50分別為14.18、8.36 μmol·L-1[8]，但在服用雷公藤多苷片的個(gè)體中，Cmax約在182～441 nmol·L-1[9]，因此在正常用藥的情況下，發(fā)生直接基于TP抑制代謝酶的DDI的可能性較低。而本研究發(fā)現(xiàn)在50～100 nmol·L-1的濃度下，TP可誘導(dǎo)CYPs在大鼠原代肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞中的CYPs表達(dá)，包括對(duì)臨床藥物代謝居前3位的CYP3A、2D、2C。鑒于雷公藤常與非甾體抗炎藥(主要代謝酶為CYP2C)聯(lián)合用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]，本研究結(jié)果提示TP與非甾體類抗炎藥共服，產(chǎn)生基于代謝酶誘導(dǎo)的DDI的可能性可能高于基于代謝酶抑制的DDI。

核受體是CYPs調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，NR1I家族的PXR和CAR可誘導(dǎo)包括CYP1、CYP2和CYP3家族在內(nèi)的多種CYPs的表達(dá)[11-12]。但在本研究中，TP作用后PXR和CAR的蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯變化，且這兩個(gè)核受體下游基因P-gp的表達(dá)水平也下調(diào)，表明PXR和CAR的活性下調(diào)；同時(shí)TP可誘導(dǎo)缺乏PXR和CAR這兩種核受體表達(dá)的HepG2細(xì)胞中的CYPs[13-14]，該結(jié)果表明，TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用可能不依賴核受體PXR和CAR的作用。

據(jù)報(bào)道，p53通過結(jié)合p53反應(yīng)元件誘導(dǎo)CYP1A1、CYP2A6和CYP3A4基因的表達(dá)[4-6]。我們前期研究表明在LNCaP細(xì)胞內(nèi)TP作用可以上調(diào)p53蛋白[15]。在大鼠原代肝細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)TP作用后p53的蛋白水平也發(fā)生了上調(diào)，進(jìn)一步采用p53抑制劑后，CYP1A2、2D2、2E1、3A1的上調(diào)作用被抑制。而在HepG2細(xì)胞中，CYP3A4和2C9的上調(diào)也被抑制。該結(jié)果提示，TP對(duì)部分CYPs的誘導(dǎo)可能是通過p53發(fā)生的，但不同種屬間可能存在調(diào)控差異。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠原代肝細(xì)胞可能成為研究TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用的體外模型；TP可在nmol·L-1級(jí)的濃度下誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞HepG2中CYPs的表達(dá)，其對(duì)部分CYPs的誘導(dǎo)作用可能是通過核受體p53的上調(diào)實(shí)現(xiàn)的，核受體PXR和CAR可能在該過程中不發(fā)揮作用；TP對(duì)CYPs的誘導(dǎo)作用可能引發(fā)同服藥物的相互作用的可能性。

(致謝:感謝轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心的老師和同學(xué)技術(shù)指導(dǎo)和幫助。)

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Investigation of inductive effect of triptolide on cytochrome P450s in rat hepatocytes and HepG2 cells and possible mechanism

YU Xi1,2,WAN Zi-jin1,2,ZHU Yan-ping1,2, XU Hai-rong1,2,LIAO Kai1,2, LIU Feng1, LI Wei1,2

(1.CollegeofMedicine,YangzhouUniversity,YangzhouJiangsu225001,China;2.JiangsuKeyLaboratoryofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineforPreventionandTreatmentofSenileDiseases,YangzhouJiangsu225001,China)

Aim To investigating the induction of CYPs in hepatocytes or HepG2 cells by triptolide(TP) and the possible mechanism.Methods After TP treatment, the expression of CYPs in rat primary hepatocytes or human HepG2 cells was detected by real-time PCR and Western blot assays.Specific inhibitors or gene knockdown method were employed to analyze the possible mechanism.Results The expression of CYP1A2, 2C7, 2C11, 2C12, 2D2, 2E1 and 3A1 in rat primary hepatocytes was induced by TP. The fold was 19, 2, 31, 3, 21, 88 and 34 at 50 nmol·L-1,respectively while at 100 nmol·L-1it was 20, 5, 30, 23, 61, 83 and 38,respectively. In HepG2 cells, the expression of human CYP1A1, 2B6, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 and 3A4 was also induced by TP. The activities of nuclear receptor PXR and CAR were inhibited.TP upregulated p53 expression, and the induction of several CYPs caused by TP was blocked when p53 was inhibited.Conclusions TP induces CYPs expression in rat hepatocytes and HepG2 cells.Nuclear receptors may not be involved in TP induced CYPs, while the mechanism may partly attribute to p53.

triptolide(TP);cytochrome P450(CYPs);nuclear receptor;p53;hepatocytes; HepG2

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.030.html

2016-11-07,

2016-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81303109);揚(yáng)州市省高校自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 14KJB310026)；揚(yáng)州市自然科學(xué)基金青年科技人才項(xiàng)目(No YZ2014020);揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃(No x2015764)

虞 茜(1991-)，女，碩士生，研究方向：抗炎藥物，E-mail:625428660@qq.com; 李 巍(1982-)，女，博士，講師，研究方向：藥物代謝，通訊作者，E-mail: weili@yzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.015

A

1001-1978(2017)03-0366-07

R-332；R284.1；R322.47；R345.99；R392.11；R977.3；R977.6