基于AQP-4、P-gp黃芩苷、梔子苷配伍對(duì)缺血/再灌注損傷大鼠血腦屏障保護(hù)機(jī)制研究

李 敏，王 斌，曹 慧, 武 璞,沈 甜,宋亞剛, 翟小虎，侯建平

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

基于AQP-4、P-gp黃芩苷、梔子苷配伍對(duì)缺血/再灌注損傷大鼠血腦屏障保護(hù)機(jī)制研究

李 敏，王 斌，曹 慧, 武 璞,沈 甜,宋亞剛, 翟小虎，侯建平

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

課題組前期發(fā)現(xiàn)，黃芩苷、梔子苷(7 ∶3)配伍具有抗腦缺血作用[1-2]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察黃芩苷、梔子苷 (7:3) 配伍對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠AQP-4、P-gp影響，探討黃芩苷、梔子苷配伍對(duì)腦缺血/再灌注損傷的血腦屏障通透性和腦水腫的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 黃芩苷(陜西中鑫生物技術(shù)有限公司，批號(hào)140821); 梔子苷(陜西維奧生物技術(shù)有限公司,批號(hào)140912)。氯丙烯(上海興光化學(xué)有限公司)；伊文斯蘭(美國(guó)Sigma公司)； P-gp、Na+、K+-ATP酶Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所)，葡萄糖、丙酮酸和乳酸生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)，AQP-4 一抗體，二抗(Chemicon公司，批號(hào)：BA1560)。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK公司)等。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 SD大鼠，♂，體質(zhì)量280～320 g，[第四軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK-(軍)2012-0007]。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、梔子苷+黃芩苷大、小劑量組(18+42) mg·kg-1、(9+21) mg·kg-1，氯丙烯組(1 g·L-1)，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等體積的4%的吐溫溶液，其余各組藥物用 4% 的吐溫溶解灌胃給藥，連續(xù)7 d。

1.4 腦缺血/再灌注損傷模型建立 末次給藥30 min以后，采用線拴法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血/再灌注模型(MCAO)[3]。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 腦含水量測(cè)定 大鼠再灌注24 h斷頭取腦，從損傷區(qū)前緣取200 mg左右腦組織，計(jì)算腦水含量/%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.2 腦組織中的EB水平檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[4]，腦缺血/再灌注損傷大鼠尾靜脈注射EB-PBS液，檢測(cè)腦組織中的EB水平。

1.5.3 腦組織中P-gp含量和Na+、K+-ATP酶活力測(cè)定 大鼠于缺血2 h/再灌22 h后斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，將患側(cè)大腦在冰上按1 ∶9生理鹽水制成10%的組織勻漿，離心后取上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定。

1.5.4 血清葡萄糖、丙酮酸和乳酸含量測(cè)定 腦缺血/再灌注損傷大鼠于缺血2 h/再灌22 h后，取血清，按試劑盒說明書操作。

1.5.5 腦組織切片制備及HE染色 缺血2 h/再灌注22 h，麻醉并4%多聚甲醛大鼠，取腦，固定、石蠟包埋，HE染色。

1.5.6 腦組織內(nèi)AQP-4 表達(dá)的檢測(cè) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腦組織中不同部位AQP-4蛋白的表達(dá)。假手術(shù)組腦組織作為對(duì)照。陽(yáng)性部位為細(xì)胞膜，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

2 結(jié)果

腦缺血模型組腦含水量、Na+，K+-ATP酶活力、EB、葡萄糖、丙酮酸、乳酸、P-gp含量明顯升高(P<0.01，P<0.05)，同時(shí)缺血大腦皮層AQP-4陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)；病理結(jié)果顯示模型組缺血區(qū)出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)不清、血管腔受壓變形、組織疏松、細(xì)胞體積增大及明顯水腫，細(xì)胞空泡樣變，神經(jīng)元胞核破碎、結(jié)構(gòu)消失。黃芩苷、梔子苷配伍能明顯降低腦含水量、Na+，K+-ATP酶活力、EB、葡萄糖、丙酮酸、P-gp含量(P<0.05)，下調(diào)AQP-4表達(dá)，并能明顯改善腦組織損傷。結(jié)果見Tab 1～3。

GroupDose/mg·kg-1EBcontent/μg·g-1Cerebralwatercontent/%Sham13.05±1.58**30±20*Model16.20±1.3460±60Baicalin+Geniposides21+913.78±3.3650±2042+1813.23±2.23*40±10*Chloropropene0.2013.94±1.43*50±10

*P<0.05，**P<0.01vsmodel

GroupDose/mg·kg-1P-gp/mg·g-1Na+,K+-ATP/10U·g-1Sham7.53±2.86*1.15±0.25*Model11.74±2.460.66±0.31Baicalin+Geniposides21+98.46±2.28*0.95±0.2442+188.09±1.67**1.03±0.19*Chloropropene0.208.23±2.26*0.98±0.19*

*P<0.05，**P<0.01vsmodel

GroupDose/mg·kg-1Glucose/mmol·L-1Pyruvicacid/mmol·L-1Lacticacid/mmol·L-1Sham6.88±1.58*0.29±0.07**31.04±10.04*Model11.22±3.910.53±0.1548.26±17.17Baicalin+Geniposides21+98.30±2.230.35±0.09*37.09±12.4242+187.50±1.68*0.31±0.12*33.50±10.39Chloropropene0.207.57±1.89*0.36±0.10*38.00±11.70

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3 討論

已知AQP-4升高星形膠質(zhì)細(xì)胞足突腫脹，血腦屏障通透性增加，促發(fā)明顯的腦水腫和梗死[5]。P-gp是血腦屏障處重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，腦缺血時(shí)，P-gp表達(dá)明顯增加，增加BBB通透性[6]。腦組織缺血缺氧時(shí)，葡萄糖進(jìn)行無氧酵解，乳酸增多，細(xì)胞膜上Na+，K+-ATP酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)液呈高滲狀態(tài)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性腦水腫。課題組發(fā)現(xiàn)黃芩苷、梔子苷配伍具有防治腦缺血/再灌注療效[7]。本實(shí)驗(yàn)探討黃芩苷、梔子苷配伍對(duì)CIRI后P-gp、葡萄糖無氧酵解及AQP-4蛋白表達(dá)的影響，闡釋其降低BBB通透性，發(fā)揮防治腦水腫的作用機(jī)制。

腦缺血模型組大鼠腦含水量、EB通過量、P-gp含量、AQP-4蛋白表達(dá)明顯升高，顯示出缺血性損傷BBB通透性明顯增強(qiáng)；缺血區(qū)細(xì)胞形態(tài)不清，有細(xì)胞體積增大、水腫，神經(jīng)元胞核破碎、結(jié)構(gòu)消失；Na+，K+-ATP酶活力降低、葡萄糖、丙酮酸及乳酸含量升高，顯示出腦缺血損失時(shí)，無氧呼吸明顯增強(qiáng)，細(xì)胞毒性明顯?？梢姡S芩苷、梔子苷(7 ∶3)配伍可能通過提高Na+，K+-ATP酶活性，降低腦組織無氧呼吸，減輕細(xì)胞毒性；降低P-gp含量、AQP-4蛋白表達(dá)，改善BBB 通透性，減輕腦水腫損傷，從而起到防治腦缺血/再灌注損傷的作用。但其體內(nèi)調(diào)控的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

[1] 陳科達(dá), 葛求富,王夢(mèng)令, 等. 黃芩苷對(duì)小鼠腦片和大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧缺糖/再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2006,41(16): 1234-7.

[1] Chen K D,Ge Q F,Wang M L,et al.Effect of Baicalin on oxygen-glucose deprivation/reperfusion-induced injury in mouse brain slices and cultured rat cortical neurons[J].ChinPharmJ, 2006,41(16): 1234-7.

[2] 李 敏, 王 斌, 唐志書, 等. 黃芩苷、梔子苷對(duì)大鼠腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制[J]. 中藥藥理與臨床, 2012, 28(3): 34.

[2] Li M,Wang B,Tang Z S, et al. Mechanism of Baicalin and Geniposide on blood brain barrier permeability in cerebral ischemia reperfusion injury rats[J].PharmacolClinChinMatMed, 2012, 28(3): 34-6.

[3] 王 斌, 于紹坤, 孫建寧, 等. 清腦宣竅滴丸對(duì)急性腦缺血損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)理初探[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2009, 15(1): 37-41.

[3] Wang B,Yu S K,Sun J N, et al. Protective effect of Qingnao Xuanqiao dropping pill on experimental ischemic injury[J].ChineJExpTraditMedFormul, 2009, 15(1): 37-41.

[4] 余 涓, 吳艷云, 翁繩美. 5-LO通路活化對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷致血腦屏障破壞的影響[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2009, 25(2): 177-83.

[4] Yu J, Wu Y Y, Weng S M .The effects of activated 5-lipoxygenase pathway on the destruction of blood-brain barrier caused by focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].ChinJNeuroanat, 2009, 25(2): 177-83.

[5] Fukuda A M, Badaut J. Aquaporin 4: a player in cerebral edema and neuroinflammation[J].JNeuroinflammation,2012,9: 279.

[6] 蔡 鳴.NKCC1和AQP-4在缺血性腦水腫中的作用機(jī)制[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2015, 31(2): 215-7.

[6] Cai M. Mechanism of action of NKCC1 and AQP-4 in ischemic brain edema[J].JModMedHealth, 2015, 31(2): 215-7.

[7] 王曉娟, 楊 力, 郭澤云.腦缺血后P-糖蛋白的表達(dá)變化及其影響因素[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2013, 29(3): 338-42.

[7] Wang X J，Yang L,Guo Z Y. Changes of P-protein expression and its influencing factors after cerebral ischemia[J].ChinJNeuroanat, 2013, 29(3): 338-42.

Effect of Baicalin and Geniposide on blood brain barrier permeability in cerebral ischemia reperfusion injury rats based on AQP-4, P-gp and its mechanism

LI Min，WANG Bin，CAO Hui, WU Pu, SHEN Tian, SONG Ya-gang, ZHAI Xiao-hu, HOU Jian-ping

(CollegeofPharmaceuticalScience,ShaanxiUniversityofChineseMedicine，XianyangShanxi712046,China)

黃芩苷+梔子苷; 腦缺血/再灌注損傷; 血腦屏障; 腦水腫；水通道蛋白；P-糖蛋白

Baicalin and Geniposide; cerebral ischemia reperfusion injury; BBB; brain edema；aquaporin-4(AQP-4); P-glycoprotein(P-gp)

時(shí)間：2017-3-4 11:51

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1151.058.html

2016-10-20,

2016-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473385)；陜西省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No 13JS029)；陜西省中管局項(xiàng)目(No 13-zy016)

李 敏(1978-)，女，博士，副教授，Tel:029-38185165,E-mail：liminsweet@126.com; 王 斌(1978-)，男，教授,通訊作者,E-mail：wangbin812@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.029

A

1001-1978(2017)03-0443-02

R-332；R284.1；R289.1；R322.81；R743.310.22；R743.310.531