遼寧省朝陽(yáng)市細(xì)粒棘球病的基因型分析

王曉黎，李 飛，李金慧，劉 靜，李亞彩，白 楊，安春麗

遼寧省朝陽(yáng)市細(xì)粒棘球病的基因型分析

王曉黎1，李 飛2，李金慧1，劉 靜1，李亞彩1，白 楊1，安春麗3

目的 分析本院分離到的人源性棘球蚴的基因型，為遼寧省棘球蚴病的分子流行病學(xué)提供資料。方法 經(jīng)外科手術(shù)方法從患者肝內(nèi)獲取棘球蚴囊，將囊內(nèi)容物離心沉淀提取DNA，以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶(cox1)基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Blast進(jìn)行分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果cox1擴(kuò)增產(chǎn)物及測(cè)序的結(jié)果提示，本例樣本與細(xì)粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差異性為0.1%，基因型屬于G1亞型。并與其他國(guó)家的25個(gè)分離株序列一致。結(jié)論 線(xiàn)粒體基因組的cox1基因分析是棘球蚴病診斷和分型的有力工具。遼寧地區(qū)首次報(bào)道了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的基因型為G1亞型，其序列與國(guó)內(nèi)外的多個(gè)分離株保持一致，為棘球蚴病的分子流行病學(xué)補(bǔ)充了資料。

細(xì)粒棘球蚴；cox1基因；基因型；分子流行病學(xué)

棘球蚴病(echinococciosis)是一種流行廣泛，危害人類(lèi)、家畜及野生動(dòng)物的人獸共患蠕蟲(chóng)病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)流行在南美，東歐，俄羅斯，中東和中國(guó)等廣大地區(qū)流行嚴(yán)重，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-4]。我國(guó)為棘球蚴病發(fā)病率高發(fā)的國(guó)家之一，目前已有25個(gè)省、自治區(qū)有病例報(bào)道，其中四川、新疆、青海、西藏的牧區(qū)發(fā)病率最高[5]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化演變過(guò)程中，棘球蚴病流行區(qū)地理氣候多樣性及其中間宿主多樣性，使寄生蟲(chóng)在與宿主之間的互相適應(yīng)中發(fā)生著變異。各地區(qū)人及動(dòng)物體內(nèi)分離到的棘球蚴的基因型有差異[6-8]。不同基因型不僅在形態(tài)學(xué)，發(fā)育過(guò)程有差異，而且對(duì)宿主特異性、人類(lèi)感染力及致病性等方面都相差很大[9]。了解棘球絳蟲(chóng)的物種分類(lèi)及基因型，可以促進(jìn)其地理分布，寄主范圍，防治策略以及對(duì)人類(lèi)健康的影響等方面的研究。我國(guó)西北及中西部流行區(qū)人及動(dòng)物的流行株及其基因型已有報(bào)道[10]，東北黑龍江地區(qū)的流行株及基因型也有描述[11]。但遼寧地區(qū)流行的基因型尚未見(jiàn)報(bào)道，本文就中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治并分離到的棘球蚴進(jìn)行了基因型分析。

1 材料方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 患者，女，57歲，遼寧省朝陽(yáng)市居民，20年前曾居住朝陽(yáng)農(nóng)村(非牧區(qū))，無(wú)確切動(dòng)物接觸史。2015年6月因自覺(jué)右上腹不適，時(shí)有牽拉隱痛等癥狀就診于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院肝膽外科，肝膽CT檢查發(fā)現(xiàn)肝臟右葉腫物，約10×10 cm，影像呈多囊性蜂房樣(參照WHO CT分型為CE2型)，診斷為肝包蟲(chóng)病并行手術(shù)切除治療。患者簽署知情同意書(shū)，醫(yī)院倫理委員會(huì)同意本研究項(xiàng)目。1.2 病原學(xué)鑒定 將手術(shù)切除的完整囊性腫物在安全保護(hù)下切一小口，抽取囊內(nèi)容物置于10 mL離心管內(nèi)，自然沉淀后，取沉淀物顯微鏡檢查，以查到典型的棘球蚴典型的原頭節(jié)為病原學(xué)鑒定依據(jù)。1.3 DNA提取 將上述包含原頭節(jié)的組織命名為分離株SY-1，用QIAamp DNA Mini Kit(51304)試劑盒，按照組織標(biāo)本說(shuō)明書(shū)方法提取DNA，置4 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道的細(xì)粒棘球蚴cox1基因的引物序列：上游引物(cox1-F)：5′-TTGTTAGGTGGTTTGTCTGA-3′下游引物(cox1-R)：5′-GGCCATCACAAATAAACA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴(kuò)增片段為895 bp，包含了常用于cox1基因型分析的部分片段。PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，2×TaqPCRMasterMix 12.5 μL，引物cox1-F、cox1-R(10 pmol/μL)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，51 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 測(cè)序及基因型分析 PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司，按目的要求進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNAman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank中的cox1[Echinococcusgranulosus](Gene ID:4097469)序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本形態(tài)學(xué)及病理學(xué)鑒定 患者經(jīng)肝膽脾CT掃描顯示肝右葉囊性病變，膽胰管MR水成像提示肝內(nèi)囊性占位。經(jīng)手術(shù)切除腫物，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)纖維囊壁組織，符合包蟲(chóng)病的病理所見(jiàn)。

A.原頭蚴(頂突外翻)；B.囊內(nèi)容物中可見(jiàn)大量棘球蚴特征性的小鉤A.Evaginated protoscolex; B. Characteristic hookets of hedatid圖1 棘球蚴的病原學(xué)鑒定Fig.1 Pathogenic identification of E.granulosus

2.2 病原學(xué)鑒定 囊內(nèi)容的沉淀物經(jīng)光學(xué)顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)典型的原頭節(jié)，即原頭蚴(圖1A)和大量棘球蚴特征性的小鉤(圖1B)，病原學(xué)鑒定為棘球蚴。2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果 如圖2所示，在1 000 bp左右處出現(xiàn)特異條帶，符合目的基因片段的大小。

M：DL-2 000分子量標(biāo)記；S：病例樣本(1 000 bp處出現(xiàn)特異條帶)；N：為陰性對(duì)照M：DL-2 000 marker；S：sample of patient(specific band at 1 000 bp)；N：negative control 圖2 分離株SY-1的cox1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of E. granulosus cox1 gene PCR product

2.4 測(cè)序及基因型分析 將分離株SY-1的測(cè)序結(jié)果應(yīng)用pubmed的Blast工具分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，發(fā)現(xiàn)147條同源序列(E value=0,相似度99%～100%)，均為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)種屬。應(yīng)用DNAman軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(E.granulosus)線(xiàn)粒體基因組(AF297617)中的cox1基因 (Gene ID:4097469)序列進(jìn)行比較分析，900 bp中僅有1 bp不同，為位于第855位堿基T→C，對(duì)應(yīng)編碼285位氨基酸絲氨酸無(wú)變化(AGT/AGC)，變異率為0.1%。分離株SY-1的核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的來(lái)源于不同國(guó)家的25條單倍體序列完全一致，見(jiàn)表1、圖3。

表1 GenBank中與分離株SY-1序列一致的分離株來(lái)源
Tab.1 Strains whose sequences are consistent with SY-1 in GenBank

分離株名稱(chēng)HaplotypesGenBank登錄號(hào)Accessionnumbers來(lái)源Localities宿主hosts參考文獻(xiàn)ReferencesEgAus04KT968705.1澳大利亞[13]H2KJ628363.1中國(guó)西藏綿羊未發(fā)表H9KJ628364.1中國(guó)西藏綿羊未發(fā)表BG4KR337821.1伊朗山羊未發(fā)表BG1KR337819.1伊朗山羊未發(fā)表EgMGL9AB893250.1蒙古人[14]EgMGL7AB893248.1蒙古人[14]EgMGL4AB893245.1蒙古人[14]EgMGL3AB893244.1蒙古人[14]EgRUS11AB777908.1俄羅斯人[15]EgRUS10AB777907.1俄羅斯人[15]EgRUS7AB777904.1俄羅斯人[15]H10AB787547.1蒙古人未發(fā)表H08AB787545.1蒙古人未發(fā)表H07AB787544.1蒙古人未發(fā)表H06AB787543.1蒙古人未發(fā)表H05AB787542.1蒙古人未發(fā)表H04AB787541.1蒙古人未發(fā)表H03AB787540.1蒙古人未發(fā)表52LI07AB786664.1中國(guó)四川人[16]EG40AB688617.1中國(guó)人[17]EG39AB688616.1中國(guó)人[17]EG33AB688610.1中國(guó)人[17]EG31AB688608.1中國(guó)人[17]EG17AB688594.1中國(guó)人[17]EG14AB688591.1中國(guó)人[17]Eg01JQ250806.1伊朗綿羊[17]-AB622277.1俄羅斯家貓[18]Sq2AY377836.1中國(guó)人未發(fā)表

圖3 分離株SY-1的COX1基因與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因組(AF297617)進(jìn)行對(duì)比結(jié)果Fig.3 Comparison of COX1 gene between SY-1 strain and mitochondrial genomes of E.granulosus (AF297617)

3 討 論

研究表明，不同種屬及不同基因型絳蟲(chóng)的地理分布，流行特征以及對(duì)宿主特異性、對(duì)人類(lèi)感染力及致病性等方面都具有很大相差[6-9]。了解棘球絳蟲(chóng)的基因型，可以促進(jìn)其地理分布，寄主范圍，防治策略以及對(duì)人類(lèi)健康的影響等方面的研究。因此，有關(guān)棘球絳蟲(chóng)種屬及種下分類(lèi)一直備受關(guān)注。以前普遍認(rèn)為棘球絳蟲(chóng)只有細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(E.granulosus)和多房棘球絳蟲(chóng)(E.multilocularis)兩種。并根據(jù)形態(tài)學(xué)將兩種絳蟲(chóng)的中絳期(metacestode)幼蟲(chóng)引起的棘球蚴病分為單房(囊型)棘球蚴病(cystic echinococcosis，即包蟲(chóng)病)和多囊(泡狀)棘球蚴病(Alveolar hydatid disease)[19]。其間，E.granulosus曾被視為是一個(gè)具有基因型和表型多態(tài)性的單一物種，并按基因序列將其分為10個(gè)基因型(G1-G10)[20-21]。然而，近年來(lái)依據(jù)進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育學(xué)(phylogenetic systematics)建立起來(lái)的棘球絳蟲(chóng)分類(lèi)方法已經(jīng)替代并修正了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。如，Nakao等[22]研究認(rèn)為導(dǎo)致囊型包蟲(chóng)病的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)其實(shí)是一個(gè)隱含了多個(gè)蟲(chóng)種的復(fù)雜的神秘物種；并且將原來(lái)的兩種棘球絳蟲(chóng)重新分為9個(gè)有效種。Spotin[23]等基于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和地理株理論，對(duì)棘球絳蟲(chóng)的線(xiàn)粒體和核糖核DNA基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果認(rèn)為原先的廣義細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)至少包括4個(gè)有效種：即E.granulosus(狹義細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)，基因型G1-G3)、E.equinus(G4)、E.ortleppi(G5)和E.canadensis。其中E.canadensis具有高度異質(zhì)性，包括有駱駝株(基因型G6)、豬株(基因型G7)和兩個(gè)鹿株(基因型G8和G10)。G9基因型的有效性受到質(zhì)疑。其中G1基因型絳蟲(chóng)分布最廣泛，呈世界性流行，羊是其最常見(jiàn)的中間宿主。全球絕大多數(shù)(88.44%)囊型包蟲(chóng)病是由基因型G1所致；全球大約11.07%的人體包蟲(chóng)病由與G1親緣關(guān)系密切的G6和G7基因型感染所致。其中，7.34%囊型包蟲(chóng)病例屬于G6基因型，主要分布于非洲和亞洲，中間宿主主要是駱駝和山羊。3.73%屬于G7型，其中間宿主為豬，主要流行于東歐國(guó)家。人體包蟲(chóng)病罕見(jiàn)由G5、G8和G10型引起。尚未發(fā)現(xiàn)有G4感染人類(lèi)的報(bào)道。我國(guó)西北及中西部，如青海省、甘肅省和新疆維吾爾自治區(qū)等地流行株主要以G1為主[10，24-27]，東北的黑龍江發(fā)現(xiàn)有G1和G7基因型病例報(bào)道[11]。

線(xiàn)粒體DNA(mtDNA) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、以母系方式遺傳，核苷酸歧異度大、進(jìn)化速度快，在種內(nèi)、種間、群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài)性，可以作為一個(gè)可靠的遺傳標(biāo)記。根據(jù)對(duì)基因的全序列變異分析，可以更全面、準(zhǔn)確地了解包蟲(chóng)病的流行特征，并對(duì)該病的預(yù)防和控制提供理論支持。本研究首次對(duì)中國(guó)遼寧省西部朝陽(yáng)地區(qū)的1例患者肝內(nèi)囊性占位病變進(jìn)行了病原學(xué)鑒定，在確診細(xì)粒棘球蚴病的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子生物學(xué)的基因分析，確定為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1型,變異率為0.1%，變異核苷酸并未影響到編碼氨基酸序列。并且該序列與澳大利亞、俄羅斯、伊朗、蒙古以及國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的分離株單倍體序列相同，為我國(guó)包蟲(chóng)病的病原流行病學(xué)提供了新的資料。

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Genetic analysis ofEchinococcusgranulosusstrain in Liaoning Province, China

WANG Xiao-li1, LI Fei2, LI Jin-hui1, LIU Jing1, LI Ya-cai1, BAI Yang1，An chun-li3

(1.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,InstituteofEndocrinology,KeyLaboratoryofEndocrineDiseasesofLiaoningProvince,theFirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China; 2.DepartmentofGastroenterologyandEndocrinology,HospitalofTacheng,ChinaMedicalUniversity,Tacheng834799,China；
3.DepartmentofMicrobiologyandParasitology,CollegeofBasicMedicalScience,ChinaMedicalUniversity,Shenyang, 110001，China

To analyze the genotype ofEchinococcusgranulosusfound in Liaoning Province, hydatid cyst was taken from the patient's liver, DNA of cyst was isolated and mitochondrialcox1 gene was sequenced substantially. Sequence results was analyzed by Blast and compared with similar strains in GenBank. Results showed that molecular analysis confirmed the echinococcosis by identical sequence of our strain withE.granulosus(AF297617) G1 genotype, with 0.1% difference. And the sequence of our strain was consistent with 25 other strains in different countries. In conclusion, genotyping of mitochondrial genecox1 is a very useful tool for diagnosis of echinococcosis. We first reported a strain ofE.granulosusin Liaoning Province, which provide novel molecular epidemiological data of this zoonosis.

Echinococcusgranulosus; Cox1 gene; genotype; molecular epidemiology

Wang Xiao-li, Email: wlittlepear@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.004

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81370189)和國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(No.81302271)聯(lián)合資助

，安春麗，Email: cmucl@126.com

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)塔城醫(yī)院消化內(nèi)分泌科，塔城 834799； 3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001

R383

A

1002-2694(2017)02-0110-05

2016-09-05 編輯：梁小潔

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81370189)