間充質(zhì)干細胞與細粒棘球絳蟲原頭節(jié)共培養(yǎng)對細粒棘球絳蟲原頭節(jié)活性的影響

鄒海亮，桂顯偉，陳賀捷，陳 帥，吳向未

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008）

細粒棘球蚴?。╟ystic echinococcosis，CE）又叫囊性包蟲病、肝包蟲病，是指由細粒棘球絳蟲的中絳期幼蟲感染引發(fā)的一種人畜共患病[1-3]。此病不僅見于人類，也可在綿羊、豬、山羊、駱駝、水牛和馬等動物中發(fā)病。目前，臨床上治療CE 的方式首選外科手術(shù)，常用的手術(shù)方式有肝包蟲內(nèi)囊摘除術(shù)、肝包蟲內(nèi)囊摘除+ 外囊部分摘除術(shù)及肝部分切除術(shù)[4]。對此病患者進行手術(shù)治療存在一定的風險，且術(shù)后其病情有復(fù)發(fā)的可能。對此病患者進行藥物治療雖然可取得一定的效果，但易對其造成肝損傷[5]。有研究指出，在CE 發(fā)病的過程中，由成纖維細胞引起的鈣鹽沉積及成骨作用在促進包蟲外囊壁的形成中起著重要作用[6]。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是來源于動物體內(nèi)中胚層的一種多能干細胞，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、營養(yǎng)細胞等多種作用，其具有自我更新與增殖能力，在適宜的微環(huán)境中具有向血管、脂肪、神經(jīng)、軟骨、骨骼等多個胚層組織和細胞內(nèi)分化的潛能。在機體發(fā)生損傷或受到刺激時，體內(nèi)所儲存的MSC 就會向損傷部位聚集，定向遷移至損傷部位并進行分化，替代損傷的細胞，以維持機體的完整性和穩(wěn)定性[7]。在CE 發(fā)展的過程中，MSC 由于歸巢作用會在患者體內(nèi)肝臟的受損處與細粒棘球絳蟲或其頭節(jié)產(chǎn)生相互作用，進而可對此病的發(fā)展起到促進作用[8]。本文主要是研究將MSC 與細粒棘球絳蟲原頭節(jié)共培養(yǎng)對細粒棘球絳蟲原頭節(jié)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗原材料

純合子C5/7 小鼠，購買于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心。自然感染CE 的綿羊，購買于新疆昌吉屠宰場。

1.2 化學試劑

磷酸緩沖溶液（PBS），胎牛血清和RPMI DMEM 培養(yǎng)基（均購自美國 Gibco-BRL 公司），Caspase-3 檢測試劑盒（購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的體外提取及培養(yǎng)方法 將感染CE 綿羊的肝臟取出，對肝臟進行清洗。準備好提取細粒棘球絳蟲原頭節(jié)所需的器械和工具，包括無菌注射器、手術(shù)刀片及刀柄、組織鑷2 ～3 個、200 ml 的無菌玻璃瓶。用注射器刺入綿羊肝臟中的包蟲囊泡內(nèi)，提取囊液與頭節(jié)的混懸液，將其置于無菌的玻璃瓶中。用PBS 對玻璃瓶中的液體進行反復(fù)沖洗，棄去上清液，重復(fù)此操作15 次以上。將提純的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)置于加有5 ml DMEM 培養(yǎng)液（內(nèi)含10% 的FBS 和1% 的雙抗）的培養(yǎng)瓶中，放入無菌恒溫培養(yǎng)箱（溫度為37.5℃，內(nèi)含濃度為5% 的二氧化）中培養(yǎng)2 d。2 d 后，采用伊- 紅染色法在倒置顯微鏡下觀察細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的活性，若其存活率≥95%，則可用于下一步試驗。

1.3.2 MSC 的提取方法 選取3 ～4 周齡的C5/7 小鼠，用頸椎脫臼法將其處死，然后將其放入濃度為75% 的酒精中浸泡10 min。10 min 后取出小鼠，用眼科小器械（小齒鑷、小剪刀）分離出小鼠下肢的長骨干。用小剪刀剪除長骨干兩側(cè)的干垢端，用1 ml 的注射器抽取2.5 ml 的DMEM培養(yǎng)液（內(nèi)含10% 的FBS 和1% 的雙抗）反復(fù)沖洗骨髓腔2 次，直至骨髓腔變白。將沖洗后的液體取出并放入一個6 cm 的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放置在無菌恒溫培養(yǎng)箱（溫度為37.5℃，內(nèi)含濃度為5% 的二氧化碳）中進行培養(yǎng)。20 ～24 h 后第一次換液，之后每隔48 h 換液一次。在細胞增殖至占整個培養(yǎng)皿底90% 以上后對其進行細胞傳代，重復(fù)以上步驟得到p3 代MSC，用于后續(xù)試驗。

1.3.3 將細粒棘球絳蟲原頭節(jié)與MSC 體外共培養(yǎng)的方法 取2 份等量的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)，將其分別作為A 組與B 組。將A 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)與培養(yǎng)好的p3 代MSC 放入6 cm的培養(yǎng)皿中進行共培養(yǎng)，對B 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)進行單獨普通培養(yǎng)。以培養(yǎng)當天、培養(yǎng)的第2 天、第4 天、第6天、第8 天和第10 天作為觀察時間節(jié)點，取兩組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)中等量的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)（約100 個），對其進行伊- 紅染色，然后在光學倒置顯微鏡下觀察其活性及存活情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用%表示，用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC 的培養(yǎng)、細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的提取及二者的共培養(yǎng)

原代的MSC 從小鼠骨髓中提取出后，24 h 內(nèi)換液去除其中的部分雜質(zhì)，干細胞的增殖能力強，約48 h 可將6 cm的培養(yǎng)皿基本鋪滿。將MSC 傳代至第p3 代MSC，可祛除培養(yǎng)皿內(nèi)的雜質(zhì)，獲得更純凈的MSC。在顯微鏡下進行觀察可見，MSC 呈梭型或紡錘型、成簇樣排列（詳見圖A）。細粒棘球絳蟲原頭節(jié)在靜止時呈圓形或類圓形，在活動時呈長條狀（詳見圖B），在顯微鏡下能觀察到蟲體的蠕動。用伊- 紅染料對新提取的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)進行浸潤后，其拒染率約為99%，表示蟲體的活性良好。將細粒棘球絳蟲原頭節(jié)放入MSC 培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)的情況詳見圖C。

2.2 培養(yǎng)期間兩組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)抗染的情況及光鏡下的形態(tài)

在培養(yǎng)期間，采用伊- 紅染色法在倒置顯微鏡下抽樣觀察兩組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的活性，結(jié)果顯示，活性較好的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)呈拒染狀態(tài)（如圖D 中綠色箭頭所指的頭節(jié)），活性差或活性較差的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)可發(fā)生頭部深染或全身深染（如圖中藍色箭頭所指的頭節(jié)）。在染色的情況下，活性較好的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)可依舊保持其頭節(jié)原有的形態(tài)（呈圓形或類圓形），活性差或活性較差的細粒棘球絳蟲原頭節(jié)呈口器逐漸外翻的狀態(tài)，蟲體膨大，其末端胚泡膨大或脫落（詳見圖D）。

2.3 培養(yǎng)期間兩組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的存活率

在培養(yǎng)期間，采用伊- 紅染色法在倒置顯微鏡下抽樣觀察兩組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的存活情況，結(jié)果顯示，B組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)隨著時間的推移其存活率逐漸下降。在培養(yǎng)的第8 天和第10 天，B 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的存活率均低于A 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 培養(yǎng)期間兩組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的存活率[n（%）]

3 討論

CE 是一種人畜共患病。細粒棘球絳蟲主要寄生于人類及牲畜等中間宿主的肝、肺、腦等器官中，可發(fā)育成包囊，對人畜的臟器功能損傷嚴重。農(nóng)牧民在感染細粒棘球絳蟲后的半年內(nèi)蟲包囊的直徑可達到0.5 ～1.0 cm，而其常因各種原因而不能及時就診，導(dǎo)致其體內(nèi)的蟲包囊每年以1 ～5 cm（直徑）的速度增長，最大直徑可達數(shù)十厘米。有報道稱，細粒棘球絳蟲外增性的生長方式及致病機理與其纖維外包膜的存在密切相關(guān)[9]。細粒棘球絳蟲纖維包膜的形成機制與成纖維細胞的鈣化機理密切相關(guān)。有報道稱，成纖維細胞可像成骨細胞一樣產(chǎn)生基質(zhì)小泡并引起小泡內(nèi)鈣鹽沉積，這一機制可能在細粒棘球絳蟲周圍纖維囊壁鈣化的形成中起到重要作用[10]。對CE 患者進行手術(shù)治療成功與否取決于其體內(nèi)細粒棘球絳蟲包囊的完整性及術(shù)中是否出現(xiàn)囊液外溢的情況。細粒棘球絳蟲包囊的外囊壁完整可為手術(shù)切除的范圍提供依據(jù)，且有助于降低患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率[11]。

MSC 具有多種分化潛能，能分泌多種細胞因子，具有調(diào)節(jié)細胞的增殖、營養(yǎng)、凋亡、支持、存活、遷移、歸巢、分化和表型等多種細胞反應(yīng)的作用[12-13]。在CE 發(fā)展的過程中，MSC 由于歸巢作用會在患者體內(nèi)肝臟的受損處與細粒棘球絳蟲或其頭節(jié)產(chǎn)生相互作用，進而可對此病的發(fā)展起到促進作用。CE 在人體內(nèi)致病的過程中，MSC 與細粒棘球絳蟲頭節(jié)及細胞均有密切接觸，且二者可相互影響，互相反饋與調(diào)節(jié)。本研究的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)期間，B 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)隨著時間的推移其存活率逐漸下降。在培養(yǎng)的第8 天和第10 天，B 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的存活率均低于A 組細粒棘球絳蟲原頭節(jié)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。究其原因可能是，將MSC 與細粒棘球絳蟲原頭節(jié)共培養(yǎng)后二者會產(chǎn)生相互刺激，促進活性因子的分泌，對細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的活性產(chǎn)生影響，但其具體影響機制仍有待進一步研究明確。

綜上所述，將MSC 與細粒棘球絳蟲原頭節(jié)共培養(yǎng)，對細粒棘球絳蟲原頭節(jié)的活性具有促進作用。本研究可能為CE 的治療提供一種新的思路。