膈下逐瘀湯對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝和血小板活化的影響

朱曉松　方濤　陳文慧　譚麗萍　石安華

[摘要] 目的 研究膈下逐瘀湯對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的治療作用及機(jī)制。 方法 雄性SD大鼠按完全隨機(jī)分組原則分為空白組、模型組和藥物干預(yù)組。空白組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)12周。8周末藥物干預(yù)組開始給藥，動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠肝組織病理變化，檢測(cè)各組大鼠肝指數(shù)、血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），肝組織TG和TC含量，以及血小板聚集率和可溶性P-選擇素（CD62p）的含量。 結(jié)果 8周末模型組HE染色的肝組織病理切片觀察到脂肪變性的肝細(xì)胞占肝小葉的比例>1/3，證明造模成功，12周末模型組大鼠各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)與空白組比較含量均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)含量均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 膈下逐瘀湯對(duì)于改善NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積有著顯著的療效，作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減少CD62p的表達(dá)、降低血小板聚集率有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 膈下逐瘀湯；非酒精性脂肪肝；血小板；可溶性P-選擇素

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（c）-0004-04

Effects of Gexia Zhuyu Decoction on lipid metabolism and platelet activation in rats with non-alcoholic fatty liver disease

ZHU Xiaosong FANG Tao CHEN Wenhui TAN Liping SHI Anhua

Basic Medical College， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Yunnan Province， Kunming 650500， China

[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of Gexia Zhuyu Decoction in rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods Male Sprague Dawley （SD） rats were randomized completely into three groups： blank group， model group and drug group. Blank group was fed with common diet， the others were fed with high-fat diet for 12 weeks. At the 8th weekend， the drug group was given Gexia Zhuyu Decoction. The pathological changes of hepatic tissue in rats of all groups were observed dynamically. The liver index， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， alanine aminotransferase （ALT） in serum， TC， TG in liver specimens， and platelet aggregation， soluble P-selectin （CD62p） were measured. Results At the end of 8th weekend， the pathological section of hepatic tissue by HE staining in model group showed that， the proportion of hepatic cells with fatty degeneration accounted for hepatic lobule was over 1/3， which proved that， the model was successful. At the end of 12th weekend， all indexes of model group were higher than those in blank group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. All indexes of drug group were lower than those in model group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Gexia Zhuyu Decoction can improve the condition of liver fatty degeneration of rats with fatty liver obviously. The mechanism may be associated with the regulation of lipid metabolism， reduction of the CD62p， inhibition of platelet aggregation.

[Key words] Gexia Zhuyu Decoction； Non-alcoholic fatty liver disease； Platelet； Soluble P-selectin

非酒精性脂肪肝（NAFLD）為我國(guó)常見的慢性肝病之一，是指除酗酒原因外引起的以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積為主要病理變化的臨床綜合征[1]?，F(xiàn)代分子病理學(xué)研究認(rèn)為其發(fā)病跟胰島素抵抗、氧化應(yīng)激及遺傳等因素有關(guān)[2]。目前治療仍以運(yùn)動(dòng)、減輕體重為主，尚無理想藥物[3]。中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為NAFLD的基本病機(jī)是痰瘀互結(jié)，治療原則以活血化瘀、健脾祛痰為主[4]。應(yīng)用活血化瘀方治療NAFLD的作用機(jī)制還未研究透徹。本研究通過喂食大鼠高脂飼料，建立早期NAFLD大鼠模型，觀察膈下逐瘀湯對(duì)NAFLD大鼠模型的作用，并從血小板活化的角度探索活血化瘀藥物膈下逐瘀湯治療NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)4周齡雄性SD大鼠120只，體重80～100 g，昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（滇）2011-0004。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 膈下逐瘀湯（處方組成：五靈脂、當(dāng)歸、川芎、桃仁、丹皮、赤芍、烏藥、玄胡索、甘草、香附、紅花、枳殼，比例：9∶9∶6∶9∶6∶6∶6∶3∶9∶3∶9∶5）。制備成含生藥量1.44 g/mL的藥液[5]，4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器試劑 Spectra Max 340PC酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司）；LBY-NJ血小板聚集儀（北京普利生儀器公司）。血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測(cè)試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；可溶性P-選擇素（CD62p）檢測(cè)試劑盒（蘇州卡爾文生物技術(shù)有限公司）。

1.2 模型建立及分組給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后編號(hào)，按完全隨機(jī)原則分為3組，空白組50只，模型組50只，藥物干預(yù)組20只?？瞻捉M喂飼基礎(chǔ)飼料，其余組給予自制高脂飼料（基礎(chǔ)飼料88%，豬油10%，膽固醇2%），自由飲水。于4、6、8周末分別處死空白組和模型組大鼠各10只，取血和肝組織樣本，動(dòng)態(tài)觀察造模情況，發(fā)現(xiàn)8周末，脂肪變性的肝細(xì)胞占肝小葉比例>1/3，為輕度脂肪肝[6-7]，因此從8周末藥物干預(yù)組每天灌胃膈下逐瘀湯[7.2 g/（kg·d）]，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周，飼料不變，第10、12周分別處死各組大鼠10只。

1.3 樣本采集

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁飲12 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清、血漿。取血后，處死大鼠，迅速取肝組織稱重，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%）。取肝左葉組織10%甲醛固定，做病理組織學(xué)檢查，肝右葉制備組織勻漿檢測(cè)肝脂。

1.4 觀察指標(biāo)

①肝組織病理學(xué)檢查；②全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清TC、TG、ALT，肝組織TG和TC含量；③按照試劑盒說明書用血小板聚集儀檢測(cè)血小板聚集率；④按照試劑盒說明書采用酶標(biāo)儀檢測(cè)CD62p。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣本符合正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較時(shí)方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）法及兩兩比較的秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon）法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白組大鼠毛發(fā)整潔有光澤，行動(dòng)靈活，飲食飲水正常，大便正常，體重穩(wěn)定增長(zhǎng)。模型組大鼠毛色暗淡，行動(dòng)遲緩，8周后食量逐漸減少，大便黏軟，部分出現(xiàn)便溏現(xiàn)象。藥物干預(yù)組毛發(fā)趨于空白組，活動(dòng)較多，大便較正常。

2.2 肝組織病理學(xué)變化

HE染色鏡下觀察（圖1，封三）：空白組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯脂肪空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊；模型組大鼠大量肝細(xì)胞內(nèi)有脂肪空泡，脂肪變性的肝細(xì)胞數(shù)目占肝小葉比例>2/3，少量肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，并伴有肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死；藥物干預(yù)組可見部分肝細(xì)胞內(nèi)有較小的脂肪空泡，脂變細(xì)胞數(shù)目不到肝小葉的1/3，無細(xì)胞壞死。蘇丹Ⅲ染色鏡下觀察（圖2，封三）：空白組大鼠肝細(xì)胞未見明顯紅色脂滴，模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴廣泛分布，藥物干預(yù)組肝細(xì)胞紅色脂滴明顯減少。

2.3 肝指數(shù)、血脂、肝脂及血清ALT的變化

與空白組比較，模型組大鼠肝指數(shù)，血清TC、TG、ALT和肝組織TC、TG含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠肝指數(shù)，血清TC、TG、ALT和肝組織TC、TG含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.4 血小板聚集率的變化

與空白組比較，模型組大鼠血小板聚集率第4周后升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），第8周后升高更明顯，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠血小板聚集率顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.5 血漿CD62p含量

與空白組比較，模型組與藥物干預(yù)組大鼠血漿CD62p含量均顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠血漿CD62p含量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表3。

3 討論

本研究采用改良高脂飼料復(fù)制NAFLD大鼠模型，由于造模時(shí)間較長(zhǎng)，若使用成年大鼠在12周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠重量太重不適合實(shí)驗(yàn)，因此采用4周齡的幼鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。第8周末肝組織切片HE染色觀察到模型組大鼠肝小葉內(nèi)超過1/3的肝細(xì)胞有脂肪空泡，為輕度脂肪肝，第12周末有超過2/3的肝細(xì)胞內(nèi)有脂肪空泡，有的空泡融合將細(xì)胞核擠到一側(cè)，有的甚至發(fā)生氣球樣變，可見點(diǎn)狀壞死灶，為中重度脂肪肝，證明NAFLD模型成立[6-7]。

膈下逐瘀湯選自王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，方中當(dāng)歸、川芎、赤芍養(yǎng)血活血；桃仁、紅花、靈脂破血逐瘀；配香附、烏藥、枳殼、元胡行氣止痛，是中醫(yī)活血化瘀的經(jīng)典方[8]。課題組前期研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，含生藥量為1.44 g/mL的藥液藥效最為顯著，因此本研究采用了該濃度的藥液。12周末空白組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性不明顯，幾乎看不到脂肪空泡；藥物干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞變性較模型組輕微，變性細(xì)胞數(shù)目較少，表明膈下逐瘀湯可以減輕模型大鼠肝細(xì)胞脂肪變性的程度。由于造模所選擇的動(dòng)物、方法、造模時(shí)間等因素的差異，未能找到本研究TC、TG、ALT準(zhǔn)確的參考范圍，但跟課題組前期研究[10-11]的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，數(shù)值還是較接近的。本研究還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)組間的比較，與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG和肝組織TC、TG含量均有不同程度的升高；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠血清TC、TG和肝組織TC、TG含量均有不同程度降低，表明膈下逐瘀湯能夠降低NAFLD模型大鼠血脂和肝脂的水平，表明其不僅可以抑制脂質(zhì)的吸收，還能促進(jìn)肝臟對(duì)脂質(zhì)的降解代謝。與空白組比較，模型組大鼠血清ALT含量明顯升高（P < 0.01），表明模型大鼠有較嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷；與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠血清ALT含量顯著降低（P < 0.01），表明膈下逐瘀湯可以減輕肝損傷，有保肝護(hù)肝的功效。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中沒有NAFLD的病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)將其歸屬于“瘀證”“肝痞”“黃疸”等范疇，其病機(jī)為氣滯血瘀、痰瘀互結(jié)[12-13]。“血瘀”在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[14]。通過對(duì)“血瘀證”的研究發(fā)現(xiàn)，其本質(zhì)是血液循環(huán)障礙，血流速度變慢，血栓形成[15]。長(zhǎng)期高脂飲食容易導(dǎo)致血脂升高，血液黏稠度增加，流動(dòng)性降低，血小板聚集性增加，血管內(nèi)皮受損，容易形成血栓，也就是出現(xiàn)了血瘀證的表現(xiàn)[16]。不難看出，血小板活化是血瘀證發(fā)生和發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)，為解釋血瘀證的病機(jī)提供了分子水平的客觀依據(jù)[17]。血小板活化分子表達(dá)增加，血小板的聚集性會(huì)增強(qiáng)，血栓形成的可能性就增加，機(jī)體就越容易出現(xiàn)血瘀證[18]。

CD62p是一種位于血小板特殊顆粒和血管內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體內(nèi)的膜糖蛋白，當(dāng)血小板受刺激時(shí)快速大量地表達(dá)于血小板膜表面，介導(dǎo)血小板和血管內(nèi)皮與炎細(xì)胞黏附以及血小板之間的黏附，進(jìn)而促進(jìn)纖維蛋白沉積和血栓形成，是目前發(fā)現(xiàn)的最能反映血小板活化程度的特異性指標(biāo)之一[19-20]。血小板聚集率是中醫(yī)血瘀證量化標(biāo)準(zhǔn)之一，血小板聚集率越高越容易形成瘀血和血栓。

與空白組比較，從第4周造模開始，血小板聚集率就開始升高，第8周末升高更明顯（P < 0.01），同時(shí)血漿CD62p含量也顯著升高（P < 0.01），表明CD62p表達(dá)增多，血小板活化，血小板聚集率升高，加重微循環(huán)障礙，從而引起脂質(zhì)代謝障礙，容易發(fā)生脂肪肝。與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠的血小板聚集率和血漿CD62p含量明顯下降（P < 0.01），表明膈下逐瘀湯可以減少CD62p的表達(dá)和血小板活化，降低模型大鼠的血小板聚集率，改善血流狀態(tài)，促進(jìn)微循環(huán)物質(zhì)交換，降低肝細(xì)胞脂肪變性的概率，從而減輕NAFLD的癥狀。本研究結(jié)果表明，以活血化瘀為主的膈下逐瘀湯減輕NAFLD大鼠模型肝脂肪變性程度和肝損傷，降低血脂、肝脂含量，可能是通過減少CD62p的表達(dá)來抑制血小板活化、降低血小板聚集率、改善血流狀態(tài)、促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝來實(shí)現(xiàn)的。本研究以方驗(yàn)證，初步揭示了NAFLD與血瘀證的關(guān)系，為臨床形成更為有效的治法方藥提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Fracanzani AL，Valenti L，Bugianesi E，et al. Risk of severe liver disease in nonalcoholic fatty liver disease with normal aminotransferase levels：a role for insulin resistance and diabetes [J]. Hepatology，2008，48（3）：792-798.

[2] Cohen JC，Horton JD，Hobbs HH. Human fatty liver disease：old questions and new insights [J]. Science，2011，332（6037）：1519-1523.

[3] 龔世梅，舒發(fā)明，馮全生.中藥復(fù)方治療非酒精性脂肪肝研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2016，37（1）：83-85.

[4] 韓莉，王觀龍，楊欽河，等.數(shù)據(jù)挖掘非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)證候及用藥特點(diǎn)[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015， 38（7）：496-500.

[5] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：科技出版社，2006：36.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）[J].中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163-166.

[7] 徐中菊，姜超，顧婷婷，等.丹芍疏肝顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠NF-кB蛋白表達(dá)的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，30（3）：64-68.

[8] 烏蘭圖婭.膈下逐瘀湯對(duì)肝瘀血療效的分析[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2015，9（19）：258-259.

[9] 李松梅，李秀芳，林青，等.參苓白術(shù)散和膈下逐瘀湯對(duì)早期脂肪肝大鼠模型血小板聚集的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23（5）：38-39.

[10] 楊銀花，王佳寧，韓雪，等.膈下逐瘀湯對(duì)早期非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響[J].中外醫(yī)療，2014， 10（33）：79-80.

[11] 楊銀花，王佳寧，韓雪，等.早期非酒精性脂肪肝大鼠血液流變學(xué)變化及膈下逐瘀湯的干預(yù)作用[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2015，10（5）：278-279.

[12] 卞瑤，黃文俊，姚政，等.去脂軟肝方對(duì)高脂誘導(dǎo)大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（1）：4-6.

[13] 李滿容.非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)證候及臨床特點(diǎn)分析[J].中醫(yī)臨床研究，2015，7（27）：17-18.

[14] 梁菁，韓榮.非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)證型研究進(jìn)展[J].新疆中醫(yī)藥，2015，33（3）：72-75.

[15] 趙浩，劉劍剛，雷燕，等.血脂異常血瘀證患者血液流動(dòng)性和流變性觀察[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2015，25（3）：23-26.

[16] 張順貞，石安華，卞瑤，等.去脂軟肝方對(duì)早期脂肪肝大鼠血脂及血液流變學(xué)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015， 30（3）：875-877.

[17] 劉玥，殷惠軍，陳可冀.血小板蛋白質(zhì)組學(xué)及其在血瘀證與活血化瘀中藥研究中的探索應(yīng)用[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2013，43（8）：619-625.

[18] 李云婷，張雷雷，張巧麗，等.血小板活化標(biāo)志物CD62P、CD63在糖尿病患者早期腎臟微血管病變中的表達(dá)[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（5）：551-553.

[19] Bonacina F，Barbieri SS，Cutuli L，et al. Vascular pentraxin 3 controls arterial thrombosis by targeting collagen and fibrinogen induced platelets aggregation [J]. Biochim Bio-phys Acta，2016，1862（6）：1182-1190.

[20] Sambola A，García Del Blanco B，Ruiz-Meana M，et al. Increased von Willebrand factor，P-selectin and fibrin content in occlusive thrombus resistant to lytic therapy [J]. Thromb Haemost，2016，115（6）：1129-1137.

（收稿日期：2016-08-07 本文編輯：張瑜杰）