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    高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)

    2017-03-02 19:09向晶陳海君施軍平
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年30期
    關(guān)鍵詞:非酒精性脂肪肝

    向晶 陳海君 施軍平

    [摘要] 目的 探討Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝組織中的表達(dá)及其意義。 方法 選取SD大鼠20只,隨機(jī)分為兩組,模型組SD大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),正常組給予普通飼料喂養(yǎng),10周末分別進(jìn)行如下檢測:①計算肝指數(shù);②HE染色,光鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理改變;③應(yīng)用RT-PCR法檢測大鼠肝組織TLR4、MyD88 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加(P<0.01);模型組的NAFLD活動度計分與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);模型組大鼠肝組織TLR4和MyD88的mRNA表達(dá)水平與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論 持續(xù)10周的高脂高糖飲食喂養(yǎng)可以誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型,模型組大鼠肝組織TLR4 mRNA和MyD88 mRNA表達(dá)升高,在肝細(xì)胞炎癥改變中起重要作用。

    [關(guān)鍵詞] 非酒精性脂肪肝;大鼠;Toll樣受體4;髓樣分化因子88

    [中圖分類號] R575.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2016)30-0024-05

    近年來非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病率逐漸升高,且呈年輕化趨勢。胡衛(wèi)等[1]對武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院教職工體檢的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),NAFLD總患病率達(dá)到20.7%,其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,但大量研究表明胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝異常在該病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。目前研究表明,Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)與感染信號的識別及轉(zhuǎn)導(dǎo)和機(jī)體的損傷密切相關(guān),將感染和炎癥、組織損傷聯(lián)系起來[3]。Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)是內(nèi)毒素識別受體,目前已知TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性和非依賴性途徑。MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo)核因子-κB(nuclear fator-κB,NF-κB)活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。本文通過研究TLR4、MyD88在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠肝組織中的表達(dá),旨在探討TLR4、MyD88在NASH炎癥反應(yīng)中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 非酒精性脂肪性肝炎動物模型的建立

    健康雄性Spraque-Dawley大鼠20只,體重180~225 g,清潔級,購買于上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號:SCXK(滬) 2008-0016],飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。20只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(予普通飼料喂養(yǎng))10只及模型組10只(予以高脂高糖飼料喂養(yǎng));于第10周處死正常組10只大鼠及模型組10只大鼠,HE染色,光鏡下觀察正常組和模型組大鼠肝組織的病理改變,以證實大鼠非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)模型成功建立。實驗動物每籠5只,分籠飼養(yǎng),均自由飲水和進(jìn)食,(20±2)℃明暗各12 h,均連續(xù)10周。

    1.2 標(biāo)本采集

    第10周末當(dāng)晚兩組大鼠禁食不禁水,次日晨空腹腹腔注射麻醉,心臟采血用于測定生化指標(biāo)和細(xì)胞因子;分離整個肝臟稱重,在肝右葉切取數(shù)塊肝組織,裝入凍存管,投入液氮中保存,進(jìn)入實驗室后移入-80℃冰箱中保存,用于提取總RNA,以檢測肝組織中TLR4、MyD88的mRNA表達(dá)。

    1.3 病理組織學(xué)檢查

    常規(guī)HE染色,光鏡下觀察大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度、氣球樣變性、小葉內(nèi)炎癥程度以評定NAFLD活動度計分(NAFLD activity score,NAS),脂肪肝病理組織學(xué)診斷參考中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組“非酒精性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)”[5]。根據(jù)肝小葉內(nèi)脂肪變的肝細(xì)胞數(shù)將脂變程度量化:0分(肝小葉內(nèi)<5%肝細(xì)胞脂肪變)、1分(肝小葉內(nèi)5%~33%肝細(xì)胞脂肪變)、2分(肝小葉內(nèi)34%~66%肝細(xì)胞脂肪變)、3分(肝小葉內(nèi)>66%肝細(xì)胞脂肪變)。肝小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計數(shù)壞死灶)計分:0分(無壞死灶)、1分(<2個壞死灶)、2分(2~4個壞死灶)、3分(>4個壞死灶)。肝細(xì)胞氣球樣變程度計分:0分(無氣球樣變)、1分(少見氣球樣變)、2分(多見氣球樣變)。NAFLD活動度計分(NAFLD activity score,NAS)為肝細(xì)胞脂肪變+小葉內(nèi)炎癥+肝細(xì)胞氣球樣變,NAS小于3分則不考慮NASH,NAS大于4分則可診斷NASH,介于兩者之間為NASH可能。

    1.4 RT-PCR檢測TLR4、MyD88 mRNA在NASH大鼠肝組織中的表達(dá)

    1.4.1 總RNA提取 從超低溫冰箱中取出冰凍的組織,約為100 mg,迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中,用研杵研磨組織,直至研磨成粉末狀,向研缽中加入2 mL RNAiso Plus,完全覆蓋研磨成粉末狀的樣品,靜置室溫中,待樣品完全融化,再用研杵研磨至裂解液呈透明狀,將勻漿液轉(zhuǎn)移至2個1.5 mL無RNA酶和無DNA酶的離心管中。離心之后,吸取上清液,移入新的1.5 mL無RNA酶和無DNA酶的離心管中,向新的勻漿裂解液中加入0.2 mL氯仿,用手劇烈震蕩15 s,12 000 r 4℃離心15 min,吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中,加入等體積的異丙醇,上下顛倒離心管充分混勻后,在室溫下靜置10 min,再次12 000 r 4℃離心10 min,棄去上清,加入75%的乙醇1 mL洗滌并干燥。最后用40~50 μL的DEPC處理水溶解RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定提取物的濃度,OD260/280比值在1.8~2.0之間。

    1.4.2 合成相關(guān)引物 從有關(guān)資料獲得所需引物,并在基因庫(Genebank)中進(jìn)行核對。引物序列見表1,由上海Invitrogen 公司合成。

    1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用上述細(xì)胞中提取的2 μL總RNA加入0.2 mL離心管中,于70℃溫育10 min,短暫離心后置于冰上。依據(jù)如下順序加入以下試劑以建立一個20 μL的反應(yīng)體系:MgCl2(25 mM)4 μL ,反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2 μL,dNTP混合物(10 mM)2 μL,重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5 μL,AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL,隨機(jī)引物1 μL,無核酸酶的水7.9 μL,總RNA 2 μL。將反應(yīng)體系于室溫溫育10 min,于42℃溫育60 min,于95℃加熱5 min,再于4℃放置5 min。即為cDNA,放入-30℃存放。

    1.4.4 PCR反應(yīng) 取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系于18 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系組成如下:2×Taq PCR Master Mix 9 μL,TLR4、MyD88上游引物 2 μL,TLR4、MyD88下游引物 2 μL,β-actin上游引物 2 μL,β-actin下游引物 2 μL,去離子水1 μL。變性94℃ 30 sec,退火58℃ 30 sec,延伸72℃ 30 sec,4℃冷卻5 min結(jié)束反應(yīng)。按上述條件循環(huán)25次,最后2%瓊脂糖凝膠電泳20 min。應(yīng)用BIO-RAD圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描,計算TLR4/β-actin及MyD88/β-actin的比值。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01表示差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組大鼠體重及肝指數(shù)比較

    實驗期間正常組大鼠靈活,精力充沛,皮膚有光澤,體重逐漸增加;模型組大鼠造模時體重較正常組逐漸增加,糞便粘臭,毛發(fā)失去光澤,漸油膩,實驗初期活動與正常組無異,第5周后大鼠活動明顯減少,體態(tài)笨重。由表2可見模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加(P<0.01)。

    2.2 兩組大鼠病理組織學(xué)變化及NAFLD活動度計分比較

    通過光鏡下觀察發(fā)現(xiàn):正常組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整;肝細(xì)胞呈多邊形圍繞中央靜脈呈放射狀分布,大小較一致,核結(jié)構(gòu)清晰可見,肝竇清晰可見。模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯,主要以小泡性為主,偶爾可見重度脂肪變性,小葉內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤形成的點(diǎn)灶狀壞死,見圖1。模型組的NAFLD活動度計分(NAFLD activity scores,NAS)與正常組比較有顯著差異(P<0.01),證實NASH模型成功建立,見表3。

    2.3 兩組大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)比較

    用RT-PCR法分別檢測NASH大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá),TLR4和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為266 bp和149 bp,與預(yù)期設(shè)計的目的片段大小相同;MyD88和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為191 bp和309 bp,與預(yù)期設(shè)計的目的片段大小相同,見圖2。模型組大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)水平與正常組比較有顯著差異(P<0.01),見表4。

    3討論

    NAFLD是指除大量飲酒、遺傳疾病、成脂藥物影響等導(dǎo)致的肝脂肪病,影像或者病理證實存在肝臟脂肪變的一種代謝性疾病[6,7],包括非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝相關(guān)肝硬化。隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢,NAFLD現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國家和我國富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因。研究發(fā)現(xiàn),在NAFLD漫長的病程中,NAFLD患者肝臟一般呈靜止?fàn)顟B(tài),隨訪10~20年肝硬化發(fā)生率僅0.6%~3%,而NASH患者10年內(nèi)肝硬化發(fā)生率為15%~25%[8],NASH為NAFLD發(fā)生肝硬化的限速步驟,因此,NAFLD引起了臨床醫(yī)師極大關(guān)注,其防治研究成為醫(yī)學(xué)研究的熱門課題之一。

    目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,以1998年Day CP[9]提出的“二次打擊學(xué)說”最為著名,即各種原因如肥胖、2型糖尿病、脂代謝紊亂等導(dǎo)致的胰島素抵抗(insulin resistance,IR),游離脂肪酸增加,肝臟脂肪代謝障礙,從而使肝細(xì)胞內(nèi)合成三酰甘油增加而輸出減少,導(dǎo)致過量的肝臟脂質(zhì)聚積,并使肝臟易受第二次打擊是“二次打擊學(xué)說”的第一步;線粒體脂肪酸氧化引起的氧化應(yīng)激,核因子-κB(nuclear fator-κB,NF-κB)依賴的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和脂肪細(xì)胞因子是所有的被認(rèn)為是導(dǎo)致第二次打擊產(chǎn)生肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化的潛在因素[10,11]。

    本研究組成員蔣艷明等[12]利用高脂高糖飲食喂養(yǎng)建立NAFLD模型,已證明其可靠性,本實驗亦采用高脂高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型,大鼠肝臟HE染色顯示肝臟脂肪變性程度加深、脂滴沉積,并可見炎癥細(xì)胞浸潤,具有典型NAFLD病理表現(xiàn),并檢測模型組大鼠肝組織中TLR4和MyD88的表達(dá)。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類最重要的模式識別受體,可識別內(nèi)源性的損傷信號相關(guān)分子模式和微生物的病原學(xué)相關(guān)分子模式,是近年來發(fā)現(xiàn)的在免疫應(yīng)答中起重要作用的細(xì)胞表面受體分子,其不僅激活先天性免疫應(yīng)答,還引起細(xì)胞因子的釋放,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁,對獲得性免疫具有重要的影響[13,14]。此類受體的基因最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn),介導(dǎo)天然免疫,能感受入侵的病原體。TLR家族至少已包括13個成員,不同的TLR配體也有所不同。Medzhitov R等[15]首次在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與果蠅中Toll受體結(jié)構(gòu)同源的受體蛋白,后來命名為Toll樣受體,主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞膜上,樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞以及表皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞也有表達(dá)。其屬于Ⅰ型跨膜蛋白(type Ⅰ transmembrance protein)受體,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)為一段富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR),可與CD14 結(jié)合,參與各種病原體的識別;跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域;胞內(nèi)區(qū)是一段約有200個氨基酸的序列,該序列與白細(xì)胞介素1(interleukin-1,IL-1)受體胞內(nèi)區(qū)具有同源性,所以又稱為Toll/IL-1 受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region,TIR),是TLRs向下游進(jìn)行信號傳遞的核心元件。當(dāng)TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到TIR區(qū)域,然后進(jìn)一步激活核因子κB(nuclear factor-κB)、絲裂原蛋白激酶信號通路,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子和白介素等基因的表達(dá)[16]。

    目前經(jīng)TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性和非依賴性途徑。MyD88依賴通路通過MyD88和IL-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-assciated kinase,IRAK)相互作用,募集TNF-受體相關(guān)因子6(tumor necrosis fator receptor-assciated fator 6,TRAF6),激活的TRAF6導(dǎo)致IκB激酶復(fù)合物活化,最終導(dǎo)致NF-κB、P38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)激活,進(jìn)一步形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子。徐正婕等[17]通過建立大鼠NASH模型,觀察肝臟內(nèi)毒素受體表達(dá)的動態(tài)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗8周時肝臟CD14和TLR4表達(dá)較正常組增高,12周進(jìn)行性增高,并于16周達(dá)到高峰。Gao Y等[18]發(fā)現(xiàn)NASH患者體內(nèi)TLR4、LBP、TNF-α的水平明顯高于對照組,推測NASH的發(fā)病可能與TLR4及LPS的表達(dá)增高有關(guān)。Liu J等[19]對TLR4野生型和突變型小鼠給予高脂高糖飲食,發(fā)現(xiàn)分別在第4、8、16周出現(xiàn)野生型小鼠肝臟脂肪沉積、脂肪沉積合并炎癥以及纖維化,TLR4、MyD88表達(dá)在第4周增加,第8周達(dá)到高峰,突變型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積則相對減輕,說明TLR4參與NAFLD的炎癥和纖維化進(jìn)程。劉濤等[20]采用高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型,檢測NAFLD組和正常組TLR4、MyD88肝組織mRNA和蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)NAFLD組大鼠肝組織中TLR4、MyD88表達(dá)均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,研究認(rèn)為TLR4信號在NAFLD大鼠模型中高表達(dá),說明其參與NAFLD的炎癥和纖維化進(jìn)程。且Jagavelu K等[21]研究發(fā)現(xiàn)必須依賴MyD88的TLR4信號途徑,內(nèi)毒素才能促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生。

    本研究中,模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加,并且模型組的NAS與正常組比較有顯著差異,在分子水平模型組TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組,同時作為TLR4下游蛋白的MyD88的mRNA結(jié)果也明顯增高。綜上所述,TRL4 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是導(dǎo)致非酒精性脂肪性大鼠肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展的原因之一。

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    (收稿日期:2016-07-12)

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