HPLC法同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量

劉 棟，宋曉紅，湯長(zhǎng)明，王麗軍，張建邦（解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室，鄭州 450042）

HPLC法同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量

劉 棟＊，宋曉紅，湯長(zhǎng)明，王麗軍，張建邦（解放軍第一五三中心醫(yī)院制劑室，鄭州 450042）

目的：建立同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Wondasil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm（芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：芍藥苷和丹酚酸B檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79～195.80 μg/mL（r＝0.999 9）、11.45～229.00 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg，檢測(cè)限分別為0.005 4、0.004 3 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.67%～102.22%（RSD＝1.26%，n＝9）、99.72%～103.28%（RSD＝1.05%，n＝9）。結(jié)論：該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時(shí)測(cè)定。

軟肝縮脾丸；芍藥苷；丹酚酸B；含量測(cè)定；高效液相色譜法

軟肝縮脾丸[批準(zhǔn)文號(hào)：濟(jì)制字（2011）F12004]為解放軍第一五三中心醫(yī)院二十多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由赤芍、丹參、黃芪、紫河車(chē)、大黃、三七等中藥材組成，具有益氣活血破瘀、軟堅(jiān)散結(jié)消痞之功效，適用于各種病因引起的慢性肝炎、肝硬化或無(wú)癥狀病毒攜帶者[1-4]；該制劑臨床療效確切、口碑較好。但該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠全面，僅有鑒別檢查和丸劑的常規(guī)檢查，缺乏含量測(cè)定項(xiàng)目，不能全面控制該制劑的質(zhì)量。依據(jù)“中國(guó)人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃”要求，同時(shí)為了進(jìn)一步控制該制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B的含量，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型HPLC儀，包括SPD-10A型紫外檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、LCsolutionLite型色譜工作站（日本Shimadzu公司）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；BT125D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；AS3120A型超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器公司，功率：120 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

軟肝縮脾丸（解放軍第一五三中心醫(yī)院自制，批號(hào)：150316、150419、150420，規(guī)格：48 g/瓶）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201136，純度：96.0%）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201313，純度：97.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取待測(cè)成分對(duì)照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加稀乙醇（量取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL，下同）溶解并定容，搖勻，即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.979、1.145 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，搖勻，即得芍藥苷和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為97.90、114.50μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，除去包衣，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷；再次稱(chēng)定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺赤芍和丹參的單一陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備單一陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下各成分均能達(dá)到基線分離（分離度＞1.5）；芍藥苷和丹酚酸B的保留時(shí)間分別在10.2 min和25.6 min左右；供試品溶液在混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的吸收峰，而陰性對(duì)照溶液則沒(méi)有相同的吸收峰。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液適量，用稀乙醇逐步稀釋制成芍藥苷質(zhì)量濃度分別為9.79、19.58、48.95、97.90、146.85、195.80 μg/mL，丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為11.45、22.90、57.25、114.50、171.75、229.00 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷、丹酚酸B的回歸方程為分別y＝14 927x—5 914.1（r＝0.999 9）、y＝14 616x—1 282.6（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，芍藥苷和丹酚酸B檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為9.79～195.80、11.45～229.00 μg/mL。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得芍藥苷和丹酚酸B的定量限分別為0.018 1、0.014 4 μg；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得芍藥苷和丹酚酸B的檢測(cè)限分別為0.005 4、0.004 3 μg。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.26%、0.72%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：150316）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.85%、0.80%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：150420）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算芍藥苷和丹酚酸B的含量。結(jié)果，芍藥苷和丹酚酸B的平均含量分別為2.882、2.985 mg/g，RSD分別為1.17%、1.14%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)150420）適量，除去包衣，研細(xì)，精密稱(chēng)取9份粉末，每份約0.5 g，分別加入一定質(zhì)量的芍藥苷和丹酚酸B對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算芍藥苷和丹酚酸B的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.1 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

筆者在試驗(yàn)過(guò)程中先后考察了提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間、提取溶劑用量對(duì)樣品所測(cè)指標(biāo)成分提取效果的影響。提取溶劑分別選取75%甲醇、75%乙醇、50%甲醇、稀乙醇進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果稀乙醇的提取率優(yōu)于前三者。提取方式考察了超聲處理1 h、回流提取1 h和浸泡過(guò)夜（18 h），結(jié)果芍藥苷采用3種方式的芍藥苷提取率沒(méi)有明顯差異，但采用超聲處理和回流提取的丹酚酸B含量要明顯高于浸泡過(guò)夜（18 h）提取方式，考慮到超聲處理簡(jiǎn)單、方便、安全，故采用超聲處理。筆者將超聲處理時(shí)間設(shè)置為0.5、1、1.5、2 h，結(jié)果芍藥苷和丹酚酸B的含量在超聲處理1、1.5、2 h時(shí)基本相同，并均明顯高于超聲處理0.5 h。筆者考察了稀乙醇用量（15、25、40、50 mL），發(fā)現(xiàn)提取溶劑用量為25、40、50 mL時(shí)，芍藥苷和丹酚酸B的提取量基本相同，并均高于提取溶劑用量為15 mL時(shí)的提取量。為了節(jié)約時(shí)間、節(jié)約試劑，因此本試驗(yàn)最終確定制備供試品溶液的方式為25 mL稀乙醇，超聲處理1 h。

3.2 流動(dòng)相的考察

筆者先后考察了不同比例的乙腈-磷酸二氫鉀溶液[5-6]、甲醇-磷酸溶液[7]、乙腈-甲醇-0.5%磷酸溶液[8-9]、乙腈-0.1%磷酸溶液[10-11]為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果，有機(jī)相含有甲醇時(shí)丹酚酸B峰與相鄰峰分離度差，水相含有磷酸二氫鉀時(shí)芍藥苷峰形有拖尾現(xiàn)象；而以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，芍藥苷和丹酚酸B峰與相鄰色譜峰分離度良好，且峰形對(duì)稱(chēng)。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取待測(cè)成分對(duì)照品適量，分別用稀乙醇溶解并稀釋成每1 mL含藥藥苷和丹酚酸B各100μg的混合對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，芍藥苷和丹酚酸B最大吸收波長(zhǎng)分別為230、286 nm。為減少測(cè)定誤差，本試驗(yàn)在230 nm波長(zhǎng)下測(cè)定芍藥苷的含量，在286 nm波長(zhǎng)下測(cè)定丹酚酸B的含量。

3.4 制劑制備及貯藏注意事項(xiàng)

試驗(yàn)過(guò)程中筆者發(fā)現(xiàn)，取生產(chǎn)日期較早（2年前的批次，已過(guò)期）的軟肝縮脾丸測(cè)定時(shí)，丹酚酸B含量下降明顯，且其色譜峰后出現(xiàn)一個(gè)半峰寬較大的未知峰，推測(cè)可能原因是丹酚酸B化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基和酯基，易發(fā)生氧化降解和水解。故軟肝縮脾丸制備過(guò)程中要嚴(yán)格控制水分含量，并包糖衣或薄膜衣，同時(shí)，建議其說(shuō)明書(shū)的貯藏項(xiàng)下增加“密閉、防潮”字樣。

綜上所述，本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于軟肝縮脾丸中芍藥苷和丹酚酸B含量的同時(shí)測(cè)定。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of Paeoniflorin and SalvianolicAcid B in Ruangan Suopi Pill by HPLC

LIU Dong，SONG Xiaohong，TANG Changming，WANG Lijun，ZHANG Jianbang（Dept.of Preparation，No.153 Central Hospital of PLA，Zhengzhou 450042，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.METHODS：HPLC was performed on the column of Wondasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 230 nm for paeoniflorin and 286 nm for salvianolic acid B，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 9.79-195.80 μg/mL（r＝0.999 9）for paeoniflorin，11.45-229.00 μg/mL（r＝0.999 9）for salvianolic acid B；the limits of quantification were 0.018 1，0.014 4 μg，limits of detection were 0.005 4，0.004 3 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the recoveries were 98.67%-102.22%（RSD＝1.26%，n＝9）and 99.72%-103.28%（RSD＝1.05%，n＝9）. CONCLUSIONS：The method is rapid，sensitive and accurate，and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin and salvianolic acid B in Ruangan suopi pill.

Ruangan suopi pill；Paeoniflorin；Salvianolic acid B；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）03-0416-03

2016-01-30

2016-07-16）

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院制劑研發(fā)與質(zhì)量控制。E-mail：liudong13673546650@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.36