布洛芬氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

詹曉亮，郭 健，苑新星，馬軍芳（.沈陽格仕特醫(yī)藥科技有限公司，遼寧本溪 7004；.沈陽興齊眼藥股份有限公司，沈陽 063）

布洛芬氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

詹曉亮1＊，郭 健2，苑新星1，馬軍芳1（1.沈陽格仕特醫(yī)藥科技有限公司，遼寧本溪 117004；2.沈陽興齊眼藥股份有限公司，沈陽 110163）

目的：建立布洛芬氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。方法：按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項下凝膠法的要求，通過干擾試驗確定樣品主成分最大無干擾質(zhì)量濃度，并進(jìn)行方法學(xué)驗證。結(jié)果：樣品稀釋至含布洛芬質(zhì)量濃度為1 mg/mL及以下時對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。結(jié)論：所建立的方法可用于布洛芬氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為0.5 EU/mL。

布洛芬氯化鈉注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；干擾試驗

布洛芬為非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，具有較強(qiáng)的抗炎、抗風(fēng)濕及解熱鎮(zhèn)痛作用，且胃腸道不良反應(yīng)較輕，耐受性好，目前在臨床中被廣泛使用，主要應(yīng)用的是其口服制劑。布洛芬氯化鈉注射液是新近開發(fā)的注射制劑，能夠進(jìn)一步擴(kuò)大該藥的臨床應(yīng)用范圍，更好地滿足患者的治療需求[1]。本研究參考2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項下凝膠法的要求[2]，建立了布洛芬氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

BET-32型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；XK96型快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）。試驗用試管、刻度吸管等玻璃器材按規(guī)定清洗，于250℃干烤1 h除去外源性內(nèi)毒素。

1.2 藥品與試劑

布洛芬氯化鈉注射液（浙江省某制藥企業(yè)，批號：13122321、13122421、13122422，規(guī)格：每100 mL含布洛芬0.4 g和氯化鈉0.8 g）；鱟試劑[TAL，福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：13090812，標(biāo)示靈敏度（λ）：0.125 EU/mL；湛江安度斯生物有限公司，批號：1202171，λ：0.125 EU/ mL，規(guī)格均為每支0.1 mL]；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，批號：130531，規(guī)格：每支10 EU）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號：13091402，規(guī)格：每支2 mL）均購自福州新北生化工業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

L按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定的公式L＝K/M計算。式中，K為人每1 kg體質(zhì)量每1 h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU/（kg·h）。M為人用每1 kg體質(zhì)量每1 h的最大樣品劑量，我國人均體質(zhì)量按60 kg計算，該制劑用于鎮(zhèn)痛時每次給藥400～800 mg，每6 h一次，每次輸注時間不少于30 min；用于發(fā)燒時每次給藥400 mg，每4～6 h一次，或每次給藥100～200 mg，每4 h一次，每次輸注時間不少于30 min，即該制劑臨床最大劑量為1 h使用800 mg（200 mL），故M＝200 mL/（60 kg·1 h）＝3.33 mL/（kg·h）。則L＝K/M＝5 EU/（kg·h）/3.33 mL/（kg· h）＝1.5 EU/mL。

按照2015年版《中國藥典》（四部）通則9301“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”中的建議[2]，限值要求可適當(dāng)嚴(yán)格，提高至計算值的1/3～1/2，以保證用藥安全。本試驗安全系數(shù)定為3，故L＝1.5（EU/mL）/3＝0.5 EU/mL。

2.2 TAL靈敏度復(fù)核

按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定，進(jìn)行TAL的靈敏度復(fù)核。根據(jù)TAL的λ＝0.125 EU/mL，用BET水溶解CSE，并配制成含細(xì)菌內(nèi)毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL）的系列濃度溶液。取復(fù)溶后的規(guī)格為每支0.1 mL的TAL原安瓿18管，其中16管分別加入0.1 mL不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行4管；另外2管加入0.1 mL BET水作為陰性對照。取2批不同廠家的TAL分別進(jìn)行試驗，結(jié)果TAL靈敏度測試值（λC）均在0.5λ～2.0λ之間，表明2批TAL的靈敏度均與λ相符，可以用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗，結(jié)果見表1（注：“+”表示試劑形成凝膠且倒轉(zhuǎn)不變形或滑落，即反應(yīng)呈陽性；“-”表示未形成凝膠或凝膠不結(jié)實、變形并脫落，即反應(yīng)呈陰性。以下各表同）。

表1 TAL的靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果Tab 1 Results of TALsensitivity recheck

2.3 干擾預(yù)試驗

目前市售TAL的λ通常為0.5～0.03 EU/mL，根據(jù)公式MVD＝cL/λ計算，則供試品最終對應(yīng)有效稀釋倍數(shù)范圍為1～16倍。取樣品（批號：13122321）適量，使用BET水稀釋制成布洛芬質(zhì)量濃度分別為4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的系列溶液，標(biāo)記為供試品陰性對照系列溶液（NPC系列，各2管）；用上述系列溶液作為溶劑，分別溶解并稀釋CSE，制得細(xì)菌內(nèi)毒素含量均為2.0λ的供試品陽性對照系列溶液（PPC系列，各2管）；同時做細(xì)菌內(nèi)毒素陽性對照溶液（PC）和BET水陰性對照溶液（NC）各2管，然后按“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”操作，進(jìn)行干擾預(yù)試驗，結(jié)果見表2。由表2可知，樣品在稀釋4倍及以上，即布洛芬質(zhì)量濃度為1 mg/mL及以下時，2批TAL對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗均沒有干擾作用。

表2 樣品干擾預(yù)試驗結(jié)果Tab 2 Results of preliminary interference test

2.4 干擾試驗

根據(jù)干擾預(yù)試驗結(jié)果，將3批樣品均照干擾預(yù)試驗稀釋方法制成含布洛芬質(zhì)量濃度為1 mg/mL的供試品溶液，將CSE稀釋制成含細(xì)菌內(nèi)毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的系列溶液，每個濃度平行4管，然后分別用λ＝0.125 EU/mL的2個廠家的TAL，按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項下的規(guī)定進(jìn)行干擾試驗。結(jié)果顯示，用BET水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es）均在0.5λ～2.0λ之間，用供試品溶液制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）均在0.5Es～2.0Es之間[2-3]。表明在此試驗條件下，樣品對TAL與細(xì)菌內(nèi)素素的凝集反應(yīng)無干擾作用，詳見表3。

表3 樣品干擾試驗結(jié)果Tab 3 Results of interference test

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批樣品各適量，照干擾預(yù)試驗稀釋方法制成含布洛芬質(zhì)量濃度為1 mg/mL的供試品溶液，分別用λ＝0.125 EU/mL的TAL（批號：13090812），按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行操作和結(jié)果判斷，結(jié)果3批樣品每1 mL中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量均小于0.5 EU，詳見表4。

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 4 Results of bacterial endotoxin test of sample

3 討論

布洛芬氯化鈉注射液作為靜脈用注射制劑，應(yīng)設(shè)立細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原檢查項。一般利用TAL法或家兔法檢查樣品所含的細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原是否符合限量規(guī)定，如果不合格，在臨床應(yīng)用時可能產(chǎn)生熱原反應(yīng)而造成嚴(yán)重的不良后果。鑒于布洛芬氯化鈉注射液具有解熱鎮(zhèn)痛作用，若采用家兔熱原檢查法可能會因其藥效學(xué)作用而出現(xiàn)假陰性結(jié)果[4]；而TAL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有方法簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點，適用于該制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并且該方法已被廣泛用于具有解熱作用的注射劑及其原料藥和臨床醫(yī)療器具中的致熱物質(zhì)的檢查[5-7]。本試驗初步建立了布洛芬氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并將其細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為：取本品，依法檢查（2015年版《中國藥典》四部通則1143），每1 mL中含細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.5 EU。

[1] 李健和，曹俊華，易利丹，等.布洛芬靜脈注射制劑的開發(fā)與臨床應(yīng)用[J].中國新藥與臨床雜志，2011，30（8）：584-587.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：154-157、400-402.

[3] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范：2010年版[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：310-321.

[4] 程春雷，高天勤，曹珍艷.注射用鹽酸丙帕他莫的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（3）：219-221.

[5] 施敬云.對乙酰氨基酚注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法建立及方法學(xué)研究[J].海峽藥學(xué)，2009，21（10）：35-37.

[6] 周繼春.雙氯芬酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立[J].醫(yī)藥論壇雜志，2015，36（4）：44-49.

[7] 周筱莉.我國細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（23）：14-16.

（編輯：周 箐）

Establishment of Bacterial Endotoxin Test Method of Ibuprofen Sodium Chloride Injection

ZHAN Xiaoliang1，GUO Jian2，YUAN Xinxing1，MA Junfang1（1.Shenyang Greatest Pharmaceutical Tech.Co.，Ltd.，Liaoning Benxi 117004，China；2.Shenyang Sinqi Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shenyang 110163，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the bacterial endotoxin test of Ibuprofen sodium chloride injection.METHODS：Maximum noninterference concentration of sample was determined by interference test according to bacterial endotoxins gelclot test stated in the general principles 1143 of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition（four）.And then methodology validation was conducted.RESULTS：Samples were diluted to 1 mg/mL，which did not interfere with bacterial endotoxin test.CONCLUSIONS：The established method can be used for the bacterial endotoxin test of Ibuprofen sodium chloride injection，and the limitation of bacterial endotoxin was 0.5 EU/mL.

Ibuprofen sodium chloride injection；Bacterial endotoxin test；Interference test

R927

A

1001-0408（2017）03-0419-03

2016-01-31

2016-12-14）

＊中級工程師。研究方向：藥物制劑。電話：024-45595201。E-mail：zhanxiaoliang@gmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.37