愈銀片的HPLC指紋圖譜研究Δ

崔小敏，石會(huì)麗，雷 琨，王曉萍（.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 70003；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安70003）

愈銀片的HPLC指紋圖譜研究Δ

崔小敏1＊，石會(huì)麗1，雷 琨1，王曉萍2#（1.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安710003）

目的：建立愈銀片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Inertsil ODS-3，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以槲皮素為參照物，測(cè)定10批愈銀片的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：10批愈銀片的HPLC圖譜有39個(gè)共有峰，相似度均＞0.96。經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為愈銀片的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

愈銀片；指紋圖譜；高效液相色譜法；銀屑病；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；槲皮素

愈銀片為陜西省中醫(yī)藥研究院專家根據(jù)中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論組方，并經(jīng)現(xiàn)代制備工藝制成的醫(yī)院制劑，由槐米、松香、牡丹皮、白芍、制何首烏、三棱、莪術(shù)等7味藥組成，具有活血軟堅(jiān)、潤(rùn)膚止癢之功效。其臨床療效確切，長(zhǎng)期應(yīng)用可清血熱、祛濕邪、止瘙癢，總有效率達(dá)95%，是治療銀屑病的良藥。方中槐米具有清熱解毒、涼血活血、潤(rùn)膚之功，列為君藥；松香可燥濕解毒，牡丹皮可清熱涼血，白芍、制何首烏可滋陰、潤(rùn)膚，四藥列為臣藥；三棱、莪術(shù)可活血化瘀、通絡(luò)列為佐使藥。目前愈銀片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有單味藥的薄層色譜（TLC）鑒別，文獻(xiàn)報(bào)道也僅有高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其中芍藥苷的含量[1]，并不能全面反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量，也無(wú)法保證制劑批間質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性。指紋圖譜的建立能夠比較全面地反映藥物中所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量[2-4]，從整體上描述和評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，對(duì)于提高中藥質(zhì)量、促進(jìn)中藥現(xiàn)代化意義重大。本試驗(yàn)采用HPLC建立了愈銀片HPLC指紋圖譜，運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)方法對(duì)10批愈銀片制劑的HPLC圖譜進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)[5-10]，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了有力的技術(shù)支持；通過(guò)對(duì)照法指認(rèn)了指紋圖譜中8個(gè)主要的色譜峰[11-13]，為治療銀屑病中藥制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)探究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A HT型HPLC儀，包括SPD-20A型紫外檢測(cè)器、LC色譜工作站（日本Shimadzu公司）；KQ-100型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；BSA124S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 藥品與試劑

愈銀片（陜西省中醫(yī)藥研究院藥劑科自制，批號(hào)：20140401、20140624、20140916、20141101、20150325、20150527、20150902、20151207、20160201、20160516，規(guī)格：0.2 g/片）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-200933）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-201407）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16031812）、二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16021005）、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16061211）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16031804）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；沒(méi)食子酸、松香酸對(duì)照品（陜西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)氫譜、碳譜鑒定結(jié)構(gòu)），以上對(duì)照品純度均＞98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.3 藥材

試驗(yàn)用藥材購(gòu)自不同藥材公司或藥材市場(chǎng)（見(jiàn)表1），經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院石會(huì)麗研究員鑒定均為真品。

表1 藥材來(lái)源Tab 1 Sources of herbs

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%→20%A；10～30 min，20%～30%A；30～60 min，30%～60%A；60～85 min，60%→95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別稱取待測(cè)成分對(duì)照品各適量，加75%甲醇溶液制成芍藥苷、丹皮酚、蘆丁、二苯乙烯苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、槲皮素、沒(méi)食子酸、松香酸質(zhì)量濃度分別為57.4、310.0、381.8、48.6、164.8、58.6、146.9、177.1μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）1.0 g，置于50 mL具塞三角瓶中，加75%甲醇25 mL，超聲處理30 min，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 單味藥材溶液 精密稱取“1.3”項(xiàng)下7種單味藥材粉末（過(guò)2號(hào)篩）各約0.15 g，同“2.2.2”項(xiàng)下方法制得單味藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，以槲皮素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，39個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.05%，相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20141101）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，以槲皮素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，39個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.07%（n＝5），相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝5），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20141101）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以槲皮素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，39個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.11%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰的歸屬和指認(rèn)

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖110 批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC overlay fingerprint chromatograms of 10 batches of samples

圖2 樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint chromatogram of samples

2.4.2 共有峰的歸屬和指認(rèn) 比較圖2中各色譜（15號(hào)峰為槲皮素）并對(duì)HPLC圖譜共有峰進(jìn)行歸屬。結(jié)果顯示，樣品HPLC圖譜39個(gè)共有峰中2、3、6、7、10、11、13、14、15、18號(hào)色譜峰來(lái)源于槐米；16、19、21、23～34、36～39號(hào)色譜峰來(lái)源于松香；1、4、5、9、17、20號(hào)色譜峰來(lái)源于白芍；1、5、9、12、14、17、20號(hào)色譜峰來(lái)源于牡丹皮；1、8號(hào)色譜峰來(lái)源于制何首烏；其余22、35號(hào)色譜峰沒(méi)有找到相應(yīng)的藥材來(lái)源。共有峰中1、5、7、8、9、15、20、39號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為沒(méi)食子酸、芍藥苷、蘆丁、二苯乙烯苷、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、槲皮素、丹皮酚、松香酸；經(jīng)統(tǒng)計(jì)，上述8個(gè)色譜峰面積之和約占共有峰總面積的78%。

2.4.3 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，10批樣品的HPLC圖譜相似度均＞0.96，詳見(jiàn)表2；各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表3、表4。

表2 10批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Results of similarity evaluation of 10 batches of samples

表310 批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of the common peaks of 10 batches of samples in HPLC chromatograms

續(xù)表3Continued Tab 3

表4 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 4 Relative peak areas of 10 batches of samples in HPLC chromatograms

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

（1）溶劑和用量考察：本試驗(yàn)考察了甲醇和乙醇作為提取溶劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，甲醇的效果明顯優(yōu)于乙醇，因此選擇甲醇作為提取溶劑。另外還考察了50%、75%、100%甲醇和25、50、100倍溶劑用量，結(jié)果表明，50倍量溶劑75%甲醇提取效率最高。（2）提取時(shí)間考察：以不同超聲時(shí)間（15、30、45、60 min）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果30 min的提取效率最高。（3）提取方法考察：以甲醇對(duì)超聲和回流兩種提取方式進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，兩種提取方式差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此選擇方便易操作的超聲提取。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

（1）色譜柱考察：分別用不同色譜柱Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果最好。（2）流動(dòng)相考察：分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果表明，乙腈-磷酸系統(tǒng)的分離效果最好。另對(duì)磷酸體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.1%、0.2%）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，0.1%和0.2%磷酸溶液分離效果相當(dāng)，均優(yōu)于0.05%磷酸溶液，從色譜柱耐受性角度考慮筆者選擇了0.1%磷酸溶液。（3）柱溫考察：在以上條件下，考察了不同柱溫（30、35、45℃）對(duì)分離的影響，結(jié)果隨著柱溫升高，分離變差，筆者最終選擇30℃柱溫。

3.3 樣品間差異分析

本試驗(yàn)以15號(hào)峰槲皮素為參照峰，計(jì)算得10批樣品39個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均在0.29%以內(nèi)，較為穩(wěn)定；大部分色譜峰相對(duì)峰面積RSD在4.8%～40%，其余主要來(lái)源于白芍的4、5號(hào)色譜峰相對(duì)峰面積RSD差異較大，說(shuō)明不同批次樣品化學(xué)成分含量存在一定差異，這種差異可能與原藥材的質(zhì)量有關(guān)，在投料生產(chǎn)時(shí)尤其要重點(diǎn)控制白芍原藥材的質(zhì)量。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為愈銀片的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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Study on the HPLC Fingerprint Chromatogram of Yuyin Tablet

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprint for chromatogram Yuyin tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Inertsil ODS-3 with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 230 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μL.Using quercetin as reference，the HPLC profiles of 10 batches of Yuyin tablet were detemined，Similarity Evaluation Software for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine（2012 edition）was used for the common peaks iolentification and similarity evaluation.RESULTS：There were 39 common peaks in the HPLC profiles of the 10 batches of Yuyin tablet，similarity degrees were higher than 0.96.It was proved that the HPLC profiles and control fingerprint profile of 10 batches of samples had good consistency.CONCLUSIONS：The established fingerprint chromatogram can provide reference for the identification and quality evaluation of Yuyin tablet.

Yuyin tablet；Fingerprint chromatograms；HPLC；Psoriasis；Quality standard；Quercetin

R927.2

A

1001-0408（2017）03-0397-04

2016-09-23

2016-11-16）

（編輯：張 靜）

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.2016SF-358）

＊研究實(shí)習(xí)員，碩士。研究方向：中藥新藥開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制。E-mail：369803637@qq.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：中藥炮制、中藥鑒定和新藥開(kāi)發(fā)利用。E-mail：893727976@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.31

CUI Xiaomin1，SHI Huili1，LEI Kun1，WANG Xiaoping2（1.Shaanxi Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi’an 710003，China；2.Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xi’an 710003，China）