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    LC—MS/MS 法測定烏苯美司及甲氨蝶呤在臨床藥物相互作用中的應(yīng)用

    2017-03-02 20:18:41劉磊佟學(xué)豐徐鑫張馨月劉志浩孟強(qiáng)
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2016年30期
    關(guān)鍵詞:甲氨蝶呤

    劉磊 佟學(xué)豐 徐鑫 張馨月 劉志浩 孟強(qiáng) 王長遠(yuǎn)

    [摘要] 目的 建立靈敏、高效、專屬性強(qiáng)的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法用于測定生物樣品中烏苯美司和甲氨蝶呤的濃度。 方法 兩種LC-MS/MS法均采用乙腈沉淀蛋白法處理生物樣品,應(yīng)用Hypersil ODS-C18色譜柱分離,通過電噴霧電離源串聯(lián)質(zhì)譜,以多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行負(fù)離子檢測,測定生物樣品中烏苯美司和甲氨蝶呤的濃度。其中,m/z 309.10 →m/z 120.30,m/z 455.20→m/z 308.20和m/z 370.40→m/z 288.10分別作為烏苯美司、甲氨蝶呤和西洛他唑(內(nèi)標(biāo))定量分析時(shí)監(jiān)測的離子對,色譜分離的流動相為乙腈-0.1%甲酸水(60∶40,=v/v),流速為0.4 mL/min。結(jié)果 苯美司、甲氨蝶呤在2.00~2000.00 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9976)。 結(jié)論 所建的LC-MS/MS法快速、靈敏、專屬性強(qiáng),適用于烏苯美司和甲氨蝶呤臨床藥代動力學(xué)研究。

    [關(guān)鍵詞] 烏苯美司;甲氨蝶呤;藥物相互作用;液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

    [中圖分類號] R927.2;R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701(2016)30-0144-05

    腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類健康的多發(fā)病、常見病?;熢诎┌Y綜合治療中處于不可缺少的重要地位,為了提高化療的療效,醫(yī)學(xué)工作者開展了多方面的研究,如開發(fā)新的高效低毒的藥物,更科學(xué)合理聯(lián)合用藥以協(xié)同增效等。其中,聯(lián)合用藥是臨床上長期使用且合理有效的治療手段,所以藥物相互作用(drug-drug-interaction,DDI)是長期困擾臨床治療的問題之一[1]。P-糖蛋白(P-gp)影響藥物代謝動力學(xué)及口服生物利用度,臨床上許多的癌癥化療藥物是P-糖蛋白的底物,都被它所外排[2,3]。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic anion transporter,OATs)將血液中的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管上皮細(xì)胞內(nèi),OATs能夠轉(zhuǎn)運(yùn)一些內(nèi)源性陰離子代謝物及某些有機(jī)陰離子藥物[4-6]。甲氨蝶呤(MTX)是治療腫瘤和一些自身免疫性疾病的有效的抗癌藥物。近些年來有報(bào)告指出,甲氨蝶呤的多藥耐藥與藥物相互作用常與P-gp和OATs有關(guān)[7-9]。烏苯美司(bestatin)是臨床上常用的一種免疫增強(qiáng)劑,用于配合其它化療藥物的治療。當(dāng)甲氨蝶呤與烏苯美司合用時(shí),這些轉(zhuǎn)運(yùn)體是否影響二者體內(nèi)動態(tài)和臨床療效也不明確[10-12]。因此,本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙㈧`敏、高效的LC-MS/MS檢測方法闡明甲氨蝶呤和烏苯美司相互作用分子藥代學(xué)機(jī)制。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器

    Agilent HP1200 液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司)API 3200 型三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);FCR 2002-UF型純水機(jī)(德國FLOM公司);HSC-24B型氮?dú)獯蹈蓛x(中國天津恒奧科技有限公司);ST-16R型高速離心機(jī)(德國Thermo公司);AL104萬分之一電子天平(梅特勒儀托利多公司)。

    1.2 試劑

    烏苯美司對照品(深圳萬樂藥業(yè)有限公司,批號:H2006 7632,純度>99.0%);甲氨蝶呤對照品(美國sigma公司,批號:119H1449,純度>99.0%);西洛他唑原料藥(IS, 浙江金立源藥業(yè)有限公司,批號:H20083045,純度>99.0%);甲醇為色譜純(美國Tedia公司),其他試劑均為分析純。

    1.3 研究對象

    健康幼年雄性Wistar大鼠,體重220~250 g由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動物中心提供,潔凈級,許可證號:SCXK(遼)2008-0002。OAT1和OAT3細(xì)胞由中科院上海藥物所宮麗琨教授友情提供。MDR1-MDCK細(xì)胞由浙江大學(xué)曾蘇教授友情提供。K562、K562/ADR細(xì)胞購自凱基生物。

    2 方法與結(jié)果

    2.1主要溶液的配制

    2.1.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取烏苯美司和甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg,用甲醇∶水(50∶50,v/v)溶液精確定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的儲備液I及2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00和2000.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;配制出低、中、高三個不同濃度的質(zhì)量控制樣品(其QC濃度分別為4.00、50.00和1000.00 ng/mL)。儲備液I以及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液均置于4℃保存,并于使用前放置至室溫。

    2.1.2 西洛他唑內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取西洛他唑標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg,用甲醇∶水(50∶50,v/v)溶液精確定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的儲備液I;精密移取9 μL內(nèi)標(biāo)儲備液I,置于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻。獲得濃度約為180 ng/mL的西洛他唑內(nèi)標(biāo)溶液。

    2.2 檢測條件

    2.2.1 色譜條件的選擇 流動相條件為:0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液(60∶40,v/v);流速為0.4 mL/min;色譜柱為Hypersil ODS-C18柱(100×2.1 mm,I.D. 5 μm,中國大連伊力特公司);柱溫為室溫,進(jìn)樣量10 μL。

    2.2.2 質(zhì)譜條件的選擇 電噴霧電離源(ESI),采用正離子模式掃描;離子噴射電壓為4700 V;溫度為570℃;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),烏苯美司 m/z 309.10→m/z 120.30、甲氨蝶呤m/z 455.20→m/z 308.20和內(nèi)標(biāo)m/z 370.40→m/z 288.10(各化合物的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物離子見圖1);碰撞能量(CE)為32 eV(烏苯美司)、27 eV(甲氨蝶呤)和20 eV(內(nèi)標(biāo)IS);掃描時(shí)間為150 ms。

    2.3 血漿樣品處理

    實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過夜(不禁水)。實(shí)驗(yàn)時(shí),先將大鼠麻醉,通過頸靜脈注射給藥后在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行頸靜脈取血。取血漿50 μL,加入50 μL甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)溶液(180 ng/mL),200 μL乙腈,渦旋混勻1 min;離心(16 099×g)10 min,取上清液于另一EP管中,37℃氮?dú)饬飨麓蹈?,殘留物加?00 μL流動相復(fù)溶,15 000 r/min 離心10 min,取上清于進(jìn)樣小瓶中,10 μL進(jìn)樣分析。

    2.4 方法專屬性實(shí)驗(yàn)

    取空白血漿50 μL加入100 μL甲醇,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,得空白血漿樣品色譜圖(圖2A)。取血漿50 μL,加入50 μL對照品溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)溶液配制成相當(dāng)于血漿濃度200 ng/mL的血漿樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,得對照品色譜圖(圖2C)。給藥30 min后的血漿處理進(jìn)樣得色譜圖(圖2D)。結(jié)果表明在選定色譜、質(zhì)譜條件下,血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對待測物無干擾,烏苯美司、甲氨蝶呤及內(nèi)標(biāo)物峰形良好,分離完全,保留時(shí)間分別為1.55 min、0.96 min和1.80 min。

    2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限的考察

    取空白血漿50 μL,加入烏苯美司和甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL,加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL,配制成相當(dāng)于血漿濃度為2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00、2000.00 ng/mL的血漿樣品,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作,每一濃度進(jìn)行三樣本分析,取10 μL進(jìn)樣分析。以待測物濃度為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(w=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得的回歸方程分別為Y1=0.00109c2+0.00173(r=0.9981)、Y2=0.00116c3+0.00378(r=0.9978)。結(jié)果表明,烏苯美司和甲氨蝶呤在2.00~2000.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取空白血漿50 μL,加入4.00 ng/mL 烏苯美司標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL,配制成相當(dāng)于血漿濃度為2.00 ng/mL,在方法確證首天對該樣品進(jìn)行6樣本分析,求出烏苯美司和甲氨蝶呤的日內(nèi)精密度(RSD)為3.24和1.97,準(zhǔn)確度(RE)為-2.5和-2.0。烏苯美司和甲氨蝶呤的定量下限是2.00 ng/ mL(見圖2B)。

    2.6精密度與準(zhǔn)確度的考察

    取大鼠空白血漿50 μL,配制低、中、高三個濃度(烏苯美司和甲氨蝶呤血漿濃度為4.00,50.00和1000.00 ng/mL)的質(zhì)量控制(QC)樣品,進(jìn)行6樣本分析,連續(xù)3 d測定,根據(jù)當(dāng)天所配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算質(zhì)量控制樣品濃度,并進(jìn)行方差分析,得出準(zhǔn)確度和精密度(表1)。以上結(jié)果表明,對于檢測生物樣品中烏苯美司和甲氨蝶呤的方法均精密、準(zhǔn)確,符合有關(guān)國際規(guī)范的要求。

    2.7 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)的考察

    烏苯美司和甲氨蝶呤質(zhì)控樣品按“2.3”項(xiàng)下方法操作。進(jìn)樣得峰面積 A1;50 μL空白血漿加入 50 μL甲醇和200 μL乙腈沉淀蛋白,渦旋,14 000 r/min離心 10 min,取上清,氮?dú)獯蹈桑尤肓鲃酉嗯渲频臑醣矫浪竞图装钡蕽舛葹?.00、50.00和1000.00 ng/mL 的對照品溶液,混勻離心后取上清進(jìn)樣,得峰面積 A2;流動相配制的烏苯美司和甲氨蝶呤濃度為4.00,50.00和1000.00 ng/mL 的對照品溶液,進(jìn)樣得峰面積 A3。每個濃度平行做平行6樣本分析。以A1/A2×100%計(jì)算得烏苯美司和甲氨蝶呤的提取回收率,以A2/A3×100%計(jì)算得到基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高濃度質(zhì)控樣品的提取回收率均>94.53%,基質(zhì)效應(yīng)在 93.45% ~ 97.27%范圍內(nèi),符合生物樣品的分析要求(表 2)。

    2.8 樣品的穩(wěn)定性考察

    將烏苯美司和甲氨蝶呤的大鼠血漿樣品置于室溫2 h,處理后的烏苯美司和甲氨蝶呤的血漿樣品置于室溫24 h,經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)以及血漿樣品-20℃冷凍15 d,考察其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察時(shí),取大鼠空白血漿50 μL,按“2.3”項(xiàng)配制出烏苯美司和甲氨蝶呤的血漿樣品,包含低、高兩個濃度(血漿濃度分別為4.00和1000.00 ng/mL),每一種濃度水平的每一種穩(wěn)定性考察進(jìn)行三樣本分析,采用LC-MS/MS法測定。結(jié)果表明烏苯美司和甲氨蝶呤的血漿樣品室溫放置2 h穩(wěn)定(RSD<4.3);處理后樣品室溫放置24 h穩(wěn)定(RSD<6.2);經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)穩(wěn)定(RSD<8.4);血液樣品-20℃冷凍15 d穩(wěn)定(RSD<6.8)。

    2.9 烏苯美司和甲氨蝶呤的大鼠體內(nèi)胃腸道吸收的相互作用

    實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過夜(不禁水)。戊巴比妥麻醉后,分別用大鼠灌胃器灌胃給藥,然后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行頸靜脈取血。實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量如下:(1)烏苯美司(4 mg/kg,對照組);(2)甲氨蝶呤(5 mg/kg,對照組);(3)烏苯美司(4 mg/kg)+甲氨蝶呤(5 mg/kg)。在特定時(shí)間時(shí)測定烏苯美司和甲氨蝶呤的大鼠血藥濃度-時(shí)間曲線(圖3A、B)與藥代動力學(xué)參數(shù)(表 3)。

    3討論

    本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法測定,其靈敏度好,準(zhǔn)確度高;用MRM掃描方式,專屬性強(qiáng);采用氮?dú)鈸]干的方法,不僅有效的將干擾組分排除,還是樣品濃縮,大大增強(qiáng)烏苯美司和甲氨蝶呤痕量分析物的檢出能力。本實(shí)驗(yàn)建立了快速、靈敏、高效的LC-MS/MS分析法,同時(shí)測定生物樣品中的烏苯美司和甲氨蝶呤。此分析方法的定量下限均可達(dá)2.00 ng/mL,并根據(jù)大鼠灌胃給藥后兩藥的的血藥濃度變化分析藥物相互作用。

    臨床上當(dāng)同為P-gp和OATs底物的抗癌藥物甲氨蝶呤和烏苯美司合用時(shí),是否會發(fā)生由藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體所介導(dǎo)的藥物相互作用有待研究[13-15]。基于這一構(gòu)想,開展了本次實(shí)驗(yàn)研究。對藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),甲氨蝶呤和烏苯美司同時(shí)灌胃給藥與單獨(dú)給藥組相比,二者的血藥濃度均升高,AUC分別由(38.40±0.70) min·μg/mL增加到(213.00±28.00) min·μg/mL(甲氨蝶呤)和(820.00±60.00)min·μg/mL增加到(1170.00±110.00) min·μg/mL(烏苯美司),二者的血漿清除率均顯著下降(圖 3A、B,表 3),提示同時(shí)給藥后,二者在腸道吸收過程中存在相互影響,導(dǎo)致彼此進(jìn)入血中的藥物濃度增加,證明了二者在胃腸道存在相互作用的靶點(diǎn),為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)藥物代謝與排泄的臨床合理用藥提供參考。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2016-08-28)

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