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    高溫和低溫條件下琥珀蠶血淋巴SOD及CAT活性的變化

    2017-02-27 11:18楊偉克唐芬芬劉增虎
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:超氧化物歧化酶

    楊偉克+唐芬芬+劉增虎

    摘要:為研究琥珀蠶在高溫和低溫脅迫條件下,血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性變化規(guī)律。對(duì)5齡琥珀蠶第3天幼蟲分別進(jìn)行38 ℃高溫和4 ℃低溫脅迫處理3 h,以室溫26 ℃飼養(yǎng)作對(duì)照,在處理停止后0、3、6、9、12 h取血淋巴,測(cè)定SOD和CAT的活性變化。結(jié)果表明:38 ℃高溫處理,引起琥珀蠶血淋巴SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢(shì),在處理停止后3 h分別達(dá)到1個(gè)峰值86.30 U/mL和108.15 U/mL,隨后逐漸減弱,最終與對(duì)照組持平。4 ℃低溫脅迫,SOD活性也是在處理停止后3 h出現(xiàn)1個(gè)峰值59.30 U/mL,隨即開始逐漸減弱,在12 h接近對(duì)照組;而CAT酶活性先下降,并低于對(duì)照,在3 h出現(xiàn)1個(gè)最低值11.09 U/mL,隨后開始升高,在6 h達(dá)到1個(gè)峰值88.68 U/mL,隨后再逐漸下降并接近對(duì)照。

    關(guān)鍵詞:琥珀蠶;血淋巴;低溫處理;高溫處理;超氧化物歧化酶;過氧化氫酶

    中圖分類號(hào):S885.9;S881.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0153-02

    琥珀蠶(Antheraea assamensis)屬鱗翅目(Lepidoptera)大蠶蛾科(Saturniidae)柞蠶屬(Antheraea)的絹絲昆蟲,是一種珍貴的野蠶資源,主要分布在印度東北部和印緬邊境地區(qū),印度人稱其為姆珈蠶(muga silkworm)[1-2]。在印度,琥珀蠶未被完全馴化,目前還不能完全在室內(nèi)飼養(yǎng),只能在野外放養(yǎng)[3]。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所于2006年在云南發(fā)現(xiàn)琥珀蠶,并對(duì)云南野生琥珀蠶進(jìn)行人工馴化飼養(yǎng),經(jīng)過幾年的探索,成功實(shí)現(xiàn)了琥珀蠶的室內(nèi)馴化飼養(yǎng),并對(duì)其形態(tài)特征、生物學(xué)特性及人工馴養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)作了相應(yīng)的研究[4]。

    目前對(duì)琥珀蠶的研究主要集中在生物學(xué)特征、飼養(yǎng)技術(shù)及繭絲性能和蠶絲蛋白等方面,至今還未見有關(guān)逆境條件下,琥珀蠶保護(hù)酶活性變化及生理生化特性的研究報(bào)道。本研究人工模擬逆境環(huán)境,對(duì)琥珀蠶5齡第3天幼蟲分別進(jìn)行高溫和低溫處理,測(cè)定其在高溫和低溫條件下SOD和CAT的活性變化,解析高溫和低溫對(duì)琥珀蠶生理生化影響的內(nèi)在機(jī)理,為后續(xù)培育琥珀蠶抗逆新品種提供生理生化鑒定參考指標(biāo)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    琥珀蠶幼蟲,由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供,在室內(nèi)26 ℃飼養(yǎng)至5齡第3天。

    1.2 試驗(yàn)方法

    試驗(yàn)分為3組;高溫處理組、低溫處理組與對(duì)照組。選擇體型大小相近的5齡第3天琥珀蠶幼蟲,分別置于38 ℃高溫和4 ℃低溫條件下沖擊3 h,以室溫26 ℃正常飼養(yǎng)為對(duì)照。

    取樣方法:分別取高溫和低溫沖擊后0、3、6、9、12 h琥珀蠶幼蟲,用脫脂棉蘸取75%乙醇進(jìn)行體表消毒、晾干,冰上取已用75%乙醇消毒過的2號(hào)昆蟲針刺其腹足,擠壓蟲體使血淋巴流出,收集到預(yù)先加有苯基硫脲的5 mL離心管中,4 ℃條件下,8 000 r/min離心5~8 min,收集上清液,用于酶活測(cè)定。每5頭蠶的血淋巴收集到1個(gè)離心管為1個(gè)重復(fù),每次取樣均設(shè)3個(gè)重復(fù),對(duì)照組同時(shí)取材。

    1.3 主要試劑及儀器

    SOD測(cè)試盒和CAT測(cè)試盒(江蘇南京建成生物科技有限公司);冰醋酸(上海聯(lián)試化工);Thermo Scientific BioMate 3S紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó))。

    1.4 血淋巴保護(hù)酶活性測(cè)定

    1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 按照SOD測(cè)定試劑盒操作。其原理是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O-2· ),后者經(jīng)氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色,用可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí),則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用,使形成的亞硝酸鹽減少,比色時(shí)測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管的吸光度,通過公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。酶活定義:1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U)。計(jì)算公式:總SOD活力(U/mL)=(D1-D2)÷D1÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。式中:D1指對(duì)照管的吸光度;D2指測(cè)定管的吸光度。

    1.4.2 過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定 參照CAT測(cè)定試劑盒操作。其原理是:過氧化氫酶(CAT)能分解H2O2生成H2O和O2,反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止,剩余H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物,在405 nm處測(cè)定其變化量,可計(jì)算CAT活力。酶活定義:1 mL樣品1 s分解 1 μmol H2O2的量為1個(gè)活力單位。計(jì)算公式:樣品CAT活力(U/mL)=(D1-D2)×271×[1/(60×取樣量)]×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。式中:D1指對(duì)照管的吸光度;D2指測(cè)定管的吸光度;271為斜率的倒數(shù);60為反應(yīng)時(shí)間60 s。

    1.4.3 數(shù)據(jù)處理及分析 采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖,同時(shí)利用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高溫和低溫處理琥珀蠶血淋巴SOD活性變化

    經(jīng)高溫38 ℃和低溫4 ℃處理后,在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi),與對(duì)照組相比,琥珀蠶血淋巴SOD活性均是先升高,在3 h達(dá)到1個(gè)峰值,隨后逐漸減弱。其中38 ℃高溫處理停止后,SOD活性上升較快,上升幅度也比較大;而低溫4 ℃處理停止后,SOD活性上升幅度相對(duì)較弱(圖1)。

    2.2 高溫和低溫處理琥珀蠶血淋巴CAT活性變化

    由圖2可以看出,高溫38 ℃和低溫4 ℃均能引起琥珀蠶血淋巴過氧化氫酶CAT活性升高。其中38 ℃高溫處理停止后,CAT酶活性在3 h達(dá)到1個(gè)峰值(最高值達(dá)到 108.15 U/mL),隨后開始逐漸減弱,在12 h接近對(duì)照。而 4 ℃ 低溫處理停止后,CAT酶活性在3 h出現(xiàn)降低,并低于對(duì)照,隨后開始逐漸升高,在6 h達(dá)到1個(gè)峰值(最高值 88.68 U/mL),然后再逐漸降低至接近對(duì)照。

    3 結(jié)論與討論

    超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)是昆蟲體內(nèi)重要的2種保護(hù)酶[5],兩者在維護(hù)生物體內(nèi)自由基代謝平衡過程中發(fā)揮了重要的作用,并在一定程度上影響生物的抗逆能力[6-7]。CAT的主要功能是參與活性氧代謝過程,它可以催化H2O2分解為H2O和O2,避免羥自由基的產(chǎn)生,防止其進(jìn)一步氧化而破壞生物大分子[8]。SOD能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng),將其歧化為H2O2和O2,H2O2再經(jīng)過CAT作用轉(zhuǎn)化為水和氧氣,從而達(dá)到清除超氧陰離子自由基的目的,維持細(xì)胞和機(jī)體的正常生理活動(dòng)[9]。

    在對(duì)家蠶和柞蠶等的研究表明,高溫或低溫脅迫均能引起蠶體自由基的過量積累,而蠶體內(nèi)的SOD和CAT在清除自由基過程中發(fā)揮了重要作用[10-12]。夏潤(rùn)璽等測(cè)定了低溫和高溫條件下,柞蠶血淋巴CAT活性變化,研究結(jié)果表明,4 ℃ 低溫處理柞蠶,其血淋巴CAT活性先下降,然后持續(xù)升高,并高于對(duì)照,處理時(shí)間越長(zhǎng),CAT上升幅度越大;用高溫40、43、46 ℃分別處理柞蠶幼蟲,均能引起柞蠶血淋巴CAT活性升高[10-11]。袁燕萍等比較了高溫36 ℃沖擊對(duì)家蠶抗氧化酶活性的影響,結(jié)果表明,高溫沖擊48~72 h,5齡家蠶幼蟲中腸組織SOD和CAT活性均有一定程度的升高,并且隨沖擊時(shí)間的的延長(zhǎng)其活性顯著增加[12]。另外,吳蕾等研究了溫度、光照周期和光照波長(zhǎng)等環(huán)境因子對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲西藏飛蝗抗氧化酶活性的影響,結(jié)果表明,在低溫處理下,SOD和CAT活性隨溫度的降低均出現(xiàn)升高趨勢(shì),在5 ℃條件下,均顯著高于對(duì)照;在高溫脅迫下,各部位的SOD和CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象,超過35 ℃后兩者的活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)溫度升高到45 ℃時(shí),SOD和CAT活性均低于對(duì)照[13]。

    室內(nèi)飼養(yǎng)琥珀蠶幼蟲的最適溫度為26~32 ℃,溫度過高或過低均不利于琥珀蠶幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至造成死亡[14]。本研究結(jié)果表明,琥珀蠶在38 ℃高溫處理停止后,相對(duì)于 26 ℃ 飼養(yǎng)的對(duì)照組,SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先升高的趨勢(shì),達(dá)到1個(gè)峰值,隨后逐漸減弱,最終與對(duì)照組持平。在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi),SOD與CAT活性上升幅度均高于低溫4 ℃處理組。這暗示38 ℃高溫脅迫誘導(dǎo)蠶體產(chǎn)生的自由基可能高于低溫4 ℃處理組,自由基濃度的持續(xù)升高,進(jìn)一步引起保護(hù)酶SOD和CAT的活性升高。

    低溫4 ℃刺激停止后,琥珀蠶血淋巴SOD也是先出現(xiàn)上升趨勢(shì),隨著時(shí)間的推移,逐漸下降,最終恢復(fù)到對(duì)照組酶活水平;而CAT活性先出現(xiàn)急劇下降,隨后升高達(dá)到1個(gè)峰值后,再逐漸減弱,在12 h時(shí)接近對(duì)照。4 ℃低溫刺激琥珀蠶,其CAT酶活先出現(xiàn)下降趨勢(shì),分析認(rèn)為很有可能是低溫4 ℃脅迫導(dǎo)致琥珀蠶機(jī)體自身營(yíng)養(yǎng)代謝水平減弱甚至短暫失調(diào),在一定程度上阻礙了CAT的合成。

    本研究結(jié)果顯示:高溫38 ℃和低溫4 ℃脅迫均能引起琥珀蠶血淋巴SOD和CAT活性在一定時(shí)間范圍內(nèi)出現(xiàn)先上升后減弱的趨勢(shì)。保護(hù)酶SOD和CAT起清除自由基的作用,其活性隨著自由基濃度的變化而變化[6]。不論是高溫還是低溫等逆境刺激對(duì)蠶體都會(huì)或多或少造成一定的損傷,打破正常的生理活動(dòng),引發(fā)蠶體產(chǎn)生過量自由基。在這種情況下,蠶體需要大量保護(hù)酶用來清除過量的自由基,維持機(jī)體正常的生命代謝活動(dòng)。隨著時(shí)間的推移,蠶體生理機(jī)能逐漸趨于正常,產(chǎn)生的自由基濃度逐漸降低,保護(hù)酶活性也開始下降,

    兩者最終維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

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