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    利用地塞米松構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型

    2017-02-27 11:16王濤曹麗萍杜金梁
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:切片空白對(duì)照肝臟

    王濤+曹麗萍+杜金梁

    摘要:用地塞米松構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型,并探索最佳建模濃度,初步探究地塞米松致建鯉肝臟脂變的作用機(jī)理。建鯉活體取肝,用振蕩切片機(jī)制備厚度為300 μm的建鯉肝切片,27 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h。將試驗(yàn)分為試驗(yàn)組和空白對(duì)照組,試驗(yàn)組用含濃度為0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L地塞米松的L-15培養(yǎng)基于 27 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,空白對(duì)照組用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間,培養(yǎng)結(jié)束后,收集試驗(yàn)組和空白對(duì)照組中上清液和肝切片。參照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性,肝切片勻漿中三磷酸腺(ATP)、總蛋白(TP)含量,甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)含量以及脂肪酸合成酶(FAS)活性。結(jié)果顯示,建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后,ATP含量變化不大;當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?.93 mg/L時(shí),試驗(yàn)組的其他指標(biāo)與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。由此說(shuō)明,用濃度為3.93 mg/L地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝切片12 h可以成功構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型。

    關(guān)鍵詞:建鯉;肝切片;地塞米松;脂變;脂肪肝;糖皮質(zhì)激素

    中圖分類(lèi)號(hào): S941.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0146-04

    肝臟作為生物體內(nèi)的重要器官,在能量代謝和物質(zhì)循環(huán)中具有重要作用,同時(shí)也是蛋白質(zhì)、脂肪合成的重要場(chǎng)所[1]。近年來(lái),隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展,魚(yú)類(lèi)脂肪肝和肝腫大普遍存在,但目前還沒(méi)有較好的治療方法,患病魚(yú)類(lèi)品質(zhì)下降,抗病能力降低,嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖健康持續(xù)發(fā)展。魚(yú)類(lèi)脂肪肝的成因復(fù)雜,普遍認(rèn)為,養(yǎng)殖條件下投喂?fàn)I養(yǎng)不均衡的配合飼料(如高糖、高脂)以及養(yǎng)殖期間投喂過(guò)量,造成肝臟脂類(lèi)物質(zhì)代謝發(fā)生障礙,脂肪沉積于肝臟的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)脂肪轉(zhuǎn)移的速度,導(dǎo)致甘油三酯在肝細(xì)胞內(nèi)異常沉積[2]。然而,有關(guān)高等哺乳動(dòng)物的研究表明,脂肪肝的形成與糖皮質(zhì)激素慢性升高有密切聯(lián)系[3]。許多研究證實(shí),糖皮質(zhì)激素影響肝臟脂肪代謝,誘導(dǎo)脂肪肝和肝腫大[4-6];過(guò)多的脂肪沉積是糖皮質(zhì)激素造成脂肪肝和肝腫大的主要原因[7]。

    集約化養(yǎng)殖條件下,魚(yú)類(lèi)受多種應(yīng)激因子刺激。當(dāng)應(yīng)激原存在時(shí),下丘腦-腦垂體-腎間組織軸受到刺激,使促腎上腺皮質(zhì)激素(adreno cortico tropic hormone,簡(jiǎn)稱(chēng)ACTH)分泌增加,ACTH作用于腎間組織,從而引起糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)分泌增加,導(dǎo)致血液中糖皮質(zhì)激素含量升高[8]。急性應(yīng)激常常導(dǎo)致皮質(zhì)醇含量數(shù)倍甚至數(shù)十倍地增加,而慢性應(yīng)激(如高密度養(yǎng)殖時(shí)的擁擠脅迫等)則使血液中皮質(zhì)醇含量在數(shù)周后仍然保持較高水平,但也有皮質(zhì)醇在1周后恢復(fù)到正常水平[9]。

    本試驗(yàn)用不同濃度的地塞米松模擬魚(yú)體內(nèi)不同含量的糖皮質(zhì)激素,恒溫培養(yǎng)的建鯉肝切片模擬魚(yú)體內(nèi)肝臟,構(gòu)建由地塞米松引起的建鯉肝臟脂變模型。目前,用地塞米松構(gòu)建肝臟脂變模型并不陌生,國(guó)內(nèi)外學(xué)者單獨(dú)或與高脂飲食并用構(gòu)建小鼠急性脂肪肝模型,但主要集中在陸生動(dòng)物上,對(duì)水生動(dòng)物研究較少。殷國(guó)俊等將孵化出96 h的斑馬魚(yú)暴露在添加50 mg/L地塞米松的水中,經(jīng)過(guò)24 h后,斑馬魚(yú)的肝臟顯著增大了40%,此階段的斑馬魚(yú)是卵黃囊為內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng),表明地塞米松在沒(méi)有外源性營(yíng)養(yǎng)的情況下,可以誘導(dǎo)斑馬魚(yú)的肝腫大(注:相關(guān)試驗(yàn)尚未公開(kāi)發(fā)表)。劉英娟等單獨(dú)使用四氯化碳成功構(gòu)建鯉魚(yú)肝細(xì)胞脂變模型,用該模型成功篩選出護(hù)肝中藥枸杞多糖[10];盧榮華等用脂肪乳劑成功構(gòu)建草魚(yú)肝細(xì)胞脂變模型[11];國(guó)外學(xué)者在青鳉魚(yú)上成功構(gòu)建肝臟脂變模型,并用該模型成功篩選出護(hù)肝藥物[12]。該試驗(yàn)通過(guò)地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝切片12 h后,成功構(gòu)建建鯉肝臟脂變模型,為篩選相關(guān)治療藥物提供理論模型。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

    試驗(yàn)用建鯉取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng),體質(zhì)健康無(wú)病。將建鯉放入循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)1周,養(yǎng)水溫度為25 ℃,每天定時(shí)定量投喂商品飼料。

    1.2 主要試劑和儀器

    地塞米松(dexamethasone)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,簡(jiǎn)稱(chēng)DMSO),購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamate pyruvic transaminase,簡(jiǎn)稱(chēng)GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,簡(jiǎn)稱(chēng)GOT)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,簡(jiǎn)稱(chēng)ATP)、總蛋白(total protein,簡(jiǎn)稱(chēng)TP)、甘油三脂(triglyceride,簡(jiǎn)稱(chēng)TG)、總膽固醇(total cholesterol,簡(jiǎn)稱(chēng)TC)、游離脂肪酸(free fatty acids,簡(jiǎn)稱(chēng)FFA)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,簡(jiǎn)稱(chēng)FAS)等試劑盒,購(gòu)自南京建成生物工程研究所;振蕩切片機(jī)、723分光光度計(jì),購(gòu)自上海欣茂儀器有限公司;酶標(biāo)儀MK3,購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

    1.3 建鯉肝切片的制備與培養(yǎng)

    無(wú)菌條件下,建鯉消毒麻醉后,超凈臺(tái)內(nèi)取出肝臟并置于PBS緩沖液中,持續(xù)通入含95% O2、5% CO2的混合氣體。用PBS緩沖液清洗肝組織3次后,用解剖刀處理成體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肝組織塊,2%的低熔點(diǎn)膠包埋,30 min后固定肝組織,振蕩切片機(jī)制備厚度為300 μm的肝切片。將上述肝組織切片置于含1 mL L-15培養(yǎng)基的24孔板中。

    1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    本試驗(yàn)設(shè)試驗(yàn)組和空白對(duì)照組,每組4個(gè)重復(fù);試驗(yàn)前,各組用L-15培養(yǎng)基27 ℃恒溫箱中預(yù)培養(yǎng)2 h后,吸棄上清??瞻讓?duì)照組換用新鮮L-15培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h,試驗(yàn)組用含濃度為0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L 地塞米松的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間,試驗(yàn)結(jié)束后收集上清液和肝切片。

    1.5 建鯉精密肝切片活力檢測(cè)

    建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)12 h后收集并稱(chēng)其質(zhì)量,加入9倍體積的沸雙蒸水,制成10%的組織勻漿,沸水中煮 10 min,3 500 r/min離心10 min,取上清液,按ATP測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定三磷酸腺苷含量。

    1.6 生化指標(biāo)測(cè)定

    地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝切片12 h后,收集上清液和肝切片。按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定TP、FFA、TG、TC的含量,GPT、GOT、FAS活性。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行整理分析。采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。其中,在0.01水平上差異顯著用“**”表示,在0.05水平上差異顯著用“*”表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 地塞米松對(duì)建鯉肝切片活性的影響

    由圖1可知,建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)12 h后,試驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比,ATP含量雖然有所降低但差異不顯著(P>0.05)。由此推斷,在該濃度劑量范圍內(nèi),地塞米松對(duì)建鯉肝切片活性的影響較小。

    2.2 地塞米松對(duì)建鯉肝切片抗氧化能力的影響

    由圖2可知,隨著地塞米松濃度的增加,超氧化物歧化酶的活性先降低,然后保持相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)?shù)厝姿蓾舛瘸^(guò)0.393 0 mg/L時(shí),試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.01);當(dāng)濃度超過(guò)3.93 mg/L后超氧化物歧化酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定。

    2.3 地塞米松對(duì)建鯉肝切片中總蛋白含量的影響

    由圖3可知,隨著地塞米松濃度的增加,總蛋白含量先逐漸降低后保持相對(duì)穩(wěn)定,當(dāng)濃度達(dá)到3.930 0 mg/L時(shí),總蛋白含量達(dá)到最低點(diǎn);超過(guò)該濃度,總蛋白含量保持相對(duì)穩(wěn)定。

    2.4 地塞米松對(duì)建鯉肝切片中GPT、GOT活性影響

    如圖4可知,GPT、GOT的活性隨著地塞米松濃度的升高,先增加后保持相對(duì)穩(wěn)定,在濃度為0.393 0 mg/L時(shí),試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05);地塞米松濃度達(dá)到并超過(guò)3.930 0 mg/L時(shí),GPT、GOT的活性保持相對(duì)穩(wěn)定。

    2.5 地塞米松對(duì)建鯉肝切片中游離脂肪酸(FFA)含量、脂肪酸合成酶(FAS)活性的影響

    如圖5可知,試驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比,當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?.393 0 mg/L時(shí),建鯉肝切片勻漿中FFA含量和FAS的活性均出現(xiàn)差異顯著性(P<0.05);當(dāng)?shù)厝姿蓾舛葹?.930 0 mg/L 時(shí)差異顯著(P<0.01),超過(guò)該濃度時(shí)FFA含量和FAS活性均保持相對(duì)穩(wěn)定。

    2.6 地塞米松對(duì)建鯉肝切片勻漿中TC、TG含量的影響

    由圖6可知,建鯉肝切片中TC、TG的含量隨著地塞米松濃度的增加先增加后保持穩(wěn)定,當(dāng)?shù)厝姿蓾舛冗_(dá)到0.393 0 mg/L 時(shí),試驗(yàn)組與空白對(duì)照組TC、TG含量差異顯著(P<0.05);濃度達(dá)到并超過(guò)3.930 0 mg/L后,TC、TG含量達(dá)到最大值且保持相對(duì)穩(wěn)定。

    3 討論

    生物體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)作為能量轉(zhuǎn)換載體,ATP含量變化直接影響器官的能量代謝[13]。因此,試驗(yàn)中將ATP含量作為評(píng)價(jià)器官活性的重要指標(biāo)。從圖1可以看出,試驗(yàn)組較空白對(duì)照組相比ATP含量有所降低,但差異并不顯著(P>0.05)。由此可以推斷,建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后活性依然良好。試驗(yàn)組ATP降低可能是因?yàn)榈厝姿缮险{(diào)磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,簡(jiǎn)稱(chēng)PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,簡(jiǎn)稱(chēng)G-6-pase)的表達(dá),促進(jìn)糖異生,并降低組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖利用效率,抑制線粒體合成ATP[14]。但從本試驗(yàn)的結(jié)果可以推測(cè)這種抑制作用是有限的,試驗(yàn)中的建鯉肝切片活性良好。

    SOD作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶[15],能有效清除機(jī)體內(nèi)超氧化物自由基,有效防止自由基對(duì)機(jī)體的損害。圖2顯示,隨著地塞米松濃度的增加,試驗(yàn)組中SOD的活性先逐漸降低,然后保持相對(duì)穩(wěn)定,在濃度為0.393 0 mg/L時(shí),試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05),當(dāng)濃度達(dá)到并超過(guò)3.930 0 mg/L 時(shí),SOD活性保持相對(duì)穩(wěn)定。

    GPT和GOT是內(nèi)源性轉(zhuǎn)氨酶,因此常常通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GPT和GOT活性來(lái)判斷細(xì)胞受損程度[16]。本試驗(yàn)中GPT和GOT的活性先是隨著地塞米松濃度的增加而增加,當(dāng)濃度達(dá)到3.930 0 mg/L時(shí)活性達(dá)到最大且保持相對(duì)穩(wěn)定。說(shuō)明地塞米松對(duì)建鯉肝切片造成了一定的損傷,這種損傷可能與地塞米松促進(jìn)磷脂氧化,增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng),增加質(zhì)膜的流動(dòng)性,改變細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。

    肝臟在蛋白質(zhì)的合成與分解過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用,動(dòng)物血漿中的蛋白質(zhì)幾乎全部在肝臟中合成。當(dāng)肝臟受到外界刺激發(fā)生損傷后,功能發(fā)生紊亂,蛋白質(zhì)的合成受阻[17-18]。本試驗(yàn)中建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)12 h后,試驗(yàn)組與空白組相比,蛋白質(zhì)含量變化明顯。導(dǎo)致該試驗(yàn)結(jié)果的主要原因可能是地塞米松影響單個(gè)核糖體組裝成多聚核糖體的效率,降低翻譯能力,進(jìn)而減弱蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)而降低蛋白質(zhì)的合成[19]。不僅如此,地塞米松通過(guò)激活肝細(xì)胞內(nèi)溶酶體和泛素蛋白酶體蛋白水解途徑促進(jìn)蛋白質(zhì)降解[20]。由圖3可以看出,當(dāng)?shù)厝姿蓾舛冗_(dá)到3.930 0 mg/L時(shí),蛋白質(zhì)含量達(dá)到最小值,超過(guò)該濃度,蛋白質(zhì)含量保持相對(duì)穩(wěn)定。說(shuō)明該濃度的地塞米松能有效抑制肝臟對(duì)蛋白質(zhì)的合成,促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解。

    肝臟不僅在蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中起重要作用,而且與脂肪代謝密切相關(guān)。已有研究證實(shí),地塞米松可以提高肝X受體(1iver X receptors,簡(jiǎn)稱(chēng)LXRs)mRNA基因的表達(dá),肝X受體合成分泌增加[21]。肝X受體上調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,簡(jiǎn)稱(chēng)SREBPs)基因的表達(dá),從而間接促進(jìn)脂肪酸合成相關(guān)基因FAS、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,簡(jiǎn)稱(chēng)ACC)基因的表達(dá)[22]。也有研究人員發(fā)現(xiàn),地塞米松能增加體外培養(yǎng)細(xì)胞中FAS的活性,直接促進(jìn)脂肪酸合成的作用[23],在本試驗(yàn)中由圖5-b可知,建鯉肝切片經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)后,F(xiàn)AS活性明顯上升,并隨著地塞米松濃度的增加而逐漸增強(qiáng),在濃度為 3.930 0 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值,之后保持相對(duì)穩(wěn)定。

    正常情況下,肝臟中的FFA脂化為T(mén)G,蛋白質(zhì)與TG結(jié)合成脂蛋白,然后轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟參與血液循環(huán)[24];TC則一部分氧化生成膽汁進(jìn)入膽囊,另一部分與蛋白質(zhì)結(jié)合后以低密度蛋白和高密度蛋白的形式轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟參與血液循環(huán)[25]。本試驗(yàn)中,由于地塞米松對(duì)建鯉肝切片的誘導(dǎo)作用,F(xiàn)AS合成分泌增加,導(dǎo)致肝臟中FFA含量升高,過(guò)多的FFA對(duì)肝臟具有毒害作用,而造成“初次打擊”[26];此外,F(xiàn)FA通過(guò)線粒體β氧化產(chǎn)生過(guò)氧化物ROS,再次對(duì)肝臟產(chǎn)生毒害作用而產(chǎn)生“二次打擊”[27]。在地塞米松濃度達(dá)到3.930 0 mg/L后,建鯉肝切片因遭2次“打擊”受損程度最為明顯,試驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。此外,肝臟中的TG含量隨FFA含量增加而增加,TC含量也隨肝臟中蛋白質(zhì)的減少而增加。肝臟中FFA、TG、TC含量異常變化最終導(dǎo)致肝臟脂肪代謝異常而脂變,甚至演變成脂肪肝。

    4 結(jié)論

    通過(guò)本試驗(yàn)得出如下結(jié)論:地塞米松對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪代謝具有重要調(diào)節(jié)作用。用濃度為3.930 0 mg/L地塞米松誘導(dǎo)建鯉肝肝切片12 h能成功構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型。

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