ZnPcS2P2介導(dǎo)的光動力療法誘導(dǎo)HL—60細胞凋亡的分子機制

趙曉燕　成玲　黃慧芳

【摘要】 目的：探討ZnPcS2P2介導(dǎo)的光動力學(xué)療法（ZnPcS2P2- PDT）誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡的分子機制。方法：應(yīng)用DNA倍體分析檢測ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞細胞周期的影響，應(yīng)用RT-PCR方法檢測ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞Bcl-2、C-myc、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）與Fas等基因mRNA表達的影響。結(jié)果：ZnPcS2P2-PDT阻止HL-60細胞從G1期進入S期，使細胞阻滯在G1期；并出現(xiàn)凋亡峰。ZnPcS2P2-PDT處理后，HL-60細胞中Bcl-2、C-myc與hTERT等基因mRNA表達水平顯著下降，而Fas基因的mRNA表達水平上升。結(jié)論：ZnPcS2P2-PDT可將HL-60細胞阻滯在G1期，誘導(dǎo)細胞凋亡，可能通過下調(diào)Bcl-2、C-myc與hTERT，上調(diào)Fas基因表達而發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】 酞菁鋅； 光動力學(xué)療法； 凋亡； HL-60細胞

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.31.007 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2016）31-0014-03

【Abstract】 Objective：To study of the molecular mechanisms of ZnPcS2P2 mediated light therapy （ZnPcS2P2-PDT） induced HL 60 apoptosis.Method：The effects of ZnPcS2P2-PDT on HL-60 cells，cell cycle were determined by DNA analysis detected by flow cytometry.The expression of Bcl-2，C-myc，hTERT（human telomerase reverse transcriptase）and Fas mRNA were detected by RT-PCR.Result：HL-60 cells were stopde from G1 phase to S phase by ZnPcS2P2-PDT， the cell were blocked in G1 phase，and appeared apoptosis phase.The mRNA expression level of Bcl-2，C-myc and hTERT decreased significantly after ZnPcS2P2-PDT.The mRNA expression of Fas increased significantly after ZnPcS2P2-PDT. Conclusion：ZnPcS2P2-PDT could arrest HL-60 cells at G1 phase and induce apoptosis by reducing the mRNA expression level of Bcl-2，C-myc and hTERT，and up-regulating the mRNA expression of Fas.

【Key words】 Zine phthalocyanine Photodynamic therapy； Apoptosis； HL-60 cells

First-authors address：Fujian Provincial Maternity and Childrens Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China

光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種發(fā)展中的腫瘤治療新方法[1]。PDT對腫瘤細胞作用的基本原理為：光敏劑接受特定波長光的光能后，通過光化學(xué)反應(yīng)和能量傳遞過程將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能，在有氧條件下，產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)（ROS），ROS對生物大分子產(chǎn)生破壞作用，使細胞的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴重影響，從而干擾腫瘤細胞的生長并導(dǎo)致其死亡，以達到治療目的[2]。本課題組前期研究結(jié)果表明ZnPcS2P2介導(dǎo)的光動力學(xué)療法（ZnPcS2P2-based-photodynamic therapy，ZnPcS2P2-PDT）對白血病細胞有顯著的選擇性殺傷作用、較好的凈化效果[3]，并可誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生線粒體相關(guān)凋亡[4]。本研究將從分子水平上初步探討ZnPcS2P2-PDT對白血病HL-60細胞的殺傷機制，為從分子水平調(diào)節(jié)白血病細胞凋亡、增強PDT的抗白血病效應(yīng)提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 光敏劑ZnPcS2P2

由福州大學(xué)化學(xué)系黃金陵、陳耐生教授提供，事先將ZnPcS2P2溶于溶劑，溶劑組成為Cremophor EL 2%（V/V），1，2丙二醇20%（V/V），NaCl 0.9%（W/W）。避光，4 ℃保存。用生理鹽水稀釋成系列濃度即為即用型。

1.2 細胞系及培養(yǎng)體系

HL-60細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。培養(yǎng)條件：含10%滅活胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所），2 mmol/L L-谷氨酰胺，常規(guī)劑量青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液（GIBCO BRL）， 置37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 隔天半量換液。細胞為對數(shù)生長期，存活細胞百分率（臺盼蘭拒染法）>95%， 以備實驗。

1.3 ZnPcS2P2-PDT處理細胞

用RPMI1640培養(yǎng)液重懸HL-60細胞，細胞密度為5×106/ml， 加入終濃度為0.5 μg/ml的ZnPcS2P2，孵育5 h后光照。同時設(shè)立空白對照組、光照對照組（單純光照）、光敏劑對照組（單純與0.5 μg/ml ZnPcS2P2共孵育，不光照）。光照條件：由LD-670半導(dǎo)體激光機（由天津醫(yī)科大學(xué)激光醫(yī)學(xué)研究室研制）輸出的670 nm激光以53 mW/cm2的功率密度、2.1 J/cm2的能量密度照射。于光照后6、12、24 h收集細胞。

1.4 DNA倍體分析檢測ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞細胞周期的影響

細胞用PBS洗滌后，用Kenesis 50試劑（Bio-Rad）染色，置流式細胞儀（美國BD公司）檢測，應(yīng)用Cell modifit軟件分析細胞周期。

1.5 ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞bcl-2、c-myc、hTERT與Fas等基因mRNA表達的影響

應(yīng)用TRIZOl（Life Technology）提取各組細胞總RNA，所提取的RNA OD260 ： OD280>1.8，經(jīng)電泳可見明亮清晰的18 s與28 s

兩條rRNA帶，說明RNA完整。cDNA合成及擴增體系參見文獻[5]。所用試劑均來自Promega公司產(chǎn)品。以β-actin為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀（Gel Doc 1000型，Bio-Rad）分析，比較各組擴增產(chǎn)物熒光強度。所用引物由上海生物工程公司合成，引物序列、片段長度及退火溫度見表1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞周期的影響

ZnPcS2P2-PDT處理后，隨著繼續(xù)孵育時間的延長，G0/G1期的HL-60細胞比例逐漸升高，上升幅度越來越明顯；于6 h出現(xiàn)了凋亡峰（Sub G1），隨后該峰逐漸明顯，24 h達到（22.75±3.96）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；S期的細胞由（67.69±0.45）%降到（42.63±1.23）%， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞Bcl-2、C-myc、hTERT和Fas mRNA表達的影響

在任何時間段，各基因mRNA的表達水平在三個對照組HL-60細胞中表達相似。ZnPcS2P2-PDT處理HL-60細胞后，Bcl-2、C-myc和hTERT的mRNA表達下調(diào)，而Fas mRNA表達上調(diào)。Bcl-2 mRNA表達于PDT處理后12 h時，下降較明顯；C-myc也是于12 h時有明顯減弱，24 h時更顯著；hTERT在6 h時就減弱，24 h時減弱最顯著。Fas mRNA表達水平于ZnPcS2P2-PDT處理后6 h就有較明顯增強，見圖1。

3 討論

凋亡相關(guān)基因的表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用，其中某些基因發(fā)生缺失或過度表達可導(dǎo)致細胞增殖失控或凋亡受阻，并產(chǎn)生抗藥性。因此，如何調(diào)控凋亡相關(guān)基因或其相應(yīng)產(chǎn)物的表達提高腫瘤細胞對干預(yù)因素的敏感性、誘導(dǎo)細胞凋亡，是腫瘤治療取得成功的關(guān)鍵。目前，研究較多的凋亡相關(guān)基因包括Bcl-2、C-myc、hTERT和Fas等。本研究從分子水平上初步探討ZnPcS2P2-PDT對HL-60細胞內(nèi)一些凋亡相關(guān)基因mRNA 表達的影響，為從分子水平調(diào)節(jié)白血病細胞凋亡、增強PDT的抗白血病效應(yīng)提供實驗依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示ZnPcS2P2-PDT處理后，G0/G1期的HL-60細胞比例明顯增高、S期的細胞比例下降，ZnPcS2P2-PDT處理后出現(xiàn)凋亡峰，上述結(jié)果表明ZnPcS2P2-PDT阻止細胞從G1期進入S期，使細胞阻滯在G1期，并發(fā)生細胞凋亡。許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤高表達Bcl-2。Bcl-2基因是一種敏感的PDT光損傷目標(biāo)[6]，PDT可使Bcl-2基因發(fā)生裂解和交聯(lián)而被破壞。本研究結(jié)果顯示Bcl-2mRNA表達于PDT處理后顯著下降， C-myc原癌基因參與細胞周期G1/S時相轉(zhuǎn)換的調(diào)控，HL-60細胞C-myc 表達水平高出正常細胞10倍，本研究結(jié)果表明ZnPcS2P2-PDT可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制C-myc基因表達，因此推測C-myc基因也是ZnPcS2P2-PDT抑制HL-60細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的調(diào)控點。端粒酶具有抗凋亡作用， 端粒酶激活是細胞永生化和腫瘤生成的重要步驟，抑制其活性可以誘導(dǎo)細胞的凋亡[7]；hTERT是端粒酶的組成成分之一，其表達與端粒酶活性密切相關(guān)，是端粒酶活性表達的唯一限制性組分。本研究結(jié)果顯示HL-60細胞hTERT mRNA表達顯著受抑。提示ZnPcS2P2-PDT可能通過抑制hTERT基因的表達降低端粒酶的活性，從而促進HL-60細胞凋亡。另有資料表明，C-myc可誘導(dǎo)hTERT基因表達而激活端粒酶[8]。本研究結(jié)果還顯示ZnPcS2P2-PDT可明顯上調(diào)Fas基因表達，提示ZnPcS2P2-PDT也可能通過啟動Fas/FasL細胞凋亡途徑而抑制HL-60細胞增殖。筆者將進一步研究Caspase-8在ZnPcS2P2-PDT誘發(fā)的細胞凋亡中的作用，揭示Fas/FasL途徑在ZnPcS2P2-PDT抗白血病過程中所發(fā)揮的作用。

參考文獻

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（收稿日期：2016-07-23）