烏司他丁對(duì)機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織中TNF—α的影響

閔軍　潘定斌　雷霆

【摘要】 目的：建立機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織，觀察TNF-α在機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織中TNF-α的變化規(guī)律，探討烏司他丁對(duì)呼吸機(jī)所致肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）的治療機(jī)制是否與抑制TNF-α的活化有關(guān)。方法：采用大潮氣量通氣建立呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷兔模型，模型成立后30、60、120、180、240 min，抽取動(dòng)脈血作血?dú)夥治觯捎肊LISA法檢測(cè)血清肺組織中TNF-α的含量，采用HE染色觀察肺組織病理變化，運(yùn)用Real-time PCR、Western Blot檢測(cè)肺組織中TNF-αRNA、蛋白的表達(dá)。結(jié)果：家兔在大潮氣量機(jī)械通氣后，隨著時(shí)間的增加血清中、肺組織中TNF-α表達(dá)顯著增加，而采呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷模型兔在使用烏司他丁干預(yù)后，動(dòng)脈血中的PaO2較前有所回升，血清與肺組織中TNF-αmRNA與蛋白的表達(dá)同大潮氣量組相比有明顯著上升（P<0.05）。結(jié)論：烏司他丁對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)TNF-α的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】 烏司他??； 呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷； 大潮氣量； TNF-α

【Abstract】 Objective：The establishment of ventilator induced lung injury in a rabbit model of lung tissue，to observe the changes of TNF-α in mechanical ventilation induced lung injury model of rabbit lung tissue alpha，to explore the therapeutic mechanism of Ulinastatin on VILI and TNF-α.Method：The injury rabbit model of high tidal volume ventilation was established，after 30，60，120，180 and 240 min，arterial blood for blood gas analysis.TNF-α in serumwere measured by ELISA.The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining.The expression of TNF-αRNA and protein in lung tissue was detected by PCR Real-time and Blot Western.Result：After mechanical ventilation，the expression of TNF-α in serum and lung tissue increased significantly.Ulinastatin interved ventilator induced lung injury model in rabbits and rabbit arterial blood PaO2 increased，in serum and lung tissue TNF-α expression were compared with those of the earlier high tidal volume group improved significantly（P<0.05）.Conclusion：Ulinastatin on ventilator induced lung injury has a protective effect， he mechanism may be by down regulating the expression of TNF-α，inhibit inflammatory reaction to achieve.

【Key words】 Ulinastatin； Ventilator associated lung injury； Tidal volume； TNF-α

First-authors address：The Second Hospital of Fuzhou Affiliated to Xiamen University，F(xiàn)uzhou 350007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.005

呼吸機(jī)所致肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）是機(jī)械通氣最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，主要由于過(guò)度機(jī)械通氣誘發(fā)或引起的急性肺損傷，危害性大，如果發(fā)現(xiàn)和處理不當(dāng)可導(dǎo)致患者死亡[1]。VILI屬于急性肺損傷，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞會(huì)在損傷后于肺內(nèi)聚集，并釋放的腫瘤壞死因子TNF-α等眾多炎性介質(zhì)，并啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)，而TNF-α等炎癥因子又對(duì)炎癥反應(yīng)的維持起重要作用[2-3]。大潮氣量機(jī)械通氣致呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷時(shí)在繼發(fā)的急性炎癥反應(yīng)的始動(dòng)與發(fā)展環(huán)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。烏司他丁對(duì)TNF-α等炎癥因子具有抑制作用，能減輕體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，值得研究。烏司他?。║linastatin，UTI）是由男性尿液中提取的絲氨酸蛋白酶抑制劑，分子量為67 kD，對(duì)TNF-α等炎癥因子具有抑制作用，從而減輕炎癥反應(yīng)[4-5]。本研究觀察TNF-α在機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型兔肺組織中的變化規(guī)律，探討烏司他丁對(duì)VILI的治療機(jī)制是否與抑制TNF-α的活化有關(guān)，并觀察烏司他丁對(duì)VILI的療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 雄性3月齡新西蘭家兔24只（清潔級(jí)），體重（2.50±0.48）kg[動(dòng)物合格證：SCXK（滬）2004-0003，上海西普爾-必凱公司]。烏司他丁（國(guó)藥準(zhǔn)字H19990133）300萬(wàn)單位。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 DEVIBISS公司NEB-2000呼吸機(jī)；血?dú)釧BL800血?dú)夥治鰞x；PE生物9600DNA擴(kuò)增儀；ABI7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀；TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）；RR036A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green I RR82LR（Takara） （大連寶生物工程公司）；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒（建成生物研究所）；TNF-α抗體（美國(guó)abcam公司），β-actin抗體（美國(guó)CST公司），Western Breeze（美國(guó)invitrogen公司），PVDF膜（Amersham公司）。

1.3 方法

1.3.1 干預(yù)前準(zhǔn)備 耳緣靜脈進(jìn)針，戊巴比妥鈉麻醉，行氣管切開(kāi)并插管，連接呼吸機(jī)。切開(kāi)左側(cè)皮膚分離頸總動(dòng)脈進(jìn)行動(dòng)脈血采集。于右側(cè)頸靜脈置靜脈套管針開(kāi)放靜脈通道，以每小時(shí)10 mL/kg持續(xù)輸注葡萄糖生理鹽水，補(bǔ)液并維持血壓穩(wěn)定。準(zhǔn)備階段的呼吸機(jī)通氣方式：容量控制（CMV）：VT 8 mL/kg，F(xiàn)iO2∶40%，I∶E=1∶2，呼氣末正壓（PEEP）3 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），維持呼吸頻率30～40次/min、PaCO2 5.32 kPa左右。

1.3.2 分組 穩(wěn)定機(jī)械30 min后記錄各項(xiàng)基礎(chǔ)參數(shù)，并將此時(shí)時(shí)間點(diǎn)記錄為0 h。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)劃分，每組8只，不同組予不同潮氣量和通氣時(shí)間：（1）常規(guī)潮氣量組：繼續(xù)初始通氣條件VT 8 mL/kg通氣。（2）大潮氣量烏司他丁組：調(diào)節(jié)呼吸機(jī)至VT 40 mL/kg、呼吸頻率8次/min。首次50 000 U/kg注射烏司他丁后，持續(xù)靜脈輸注5000 U/（kg·h）。（3）大潮氣量對(duì)照組：調(diào)節(jié)呼吸機(jī)至VT 40 mL/kg、呼吸頻率8次/min。持續(xù)靜脈輸注地塞米松0.5 mg/（kg·h）。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo) 在分組操作完成后30、60、120、180、240 min，抽取動(dòng)脈血行血?dú)夥治?，抽取靜脈血檢測(cè)血清中TNF-α的含量。取血完處死后取肺組織，用于mRNA與蛋白的檢測(cè)。

1.3.3.1 血清肺組織中TNF-α含量的檢測(cè) 靜脈血離心取血清，肺組織液氮搗碎勻漿于組織稀釋液中，試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品分別加入96孔板上。并先后加入生物素、酶標(biāo)底物，37 ℃溫育60 min。加入終止液終止反應(yīng)，顯色15 min后，于酶標(biāo)儀450 nm讀取OD值。

1.3.3.2 肺組織TNF-α蛋白的檢測(cè) 提取肺組織的蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，以30 μg/道上樣，進(jìn)行SDS-PGEE凝膠電泳， 然后采用半干轉(zhuǎn)將膠上蛋白印至PVDF膜。室溫封閉30 min。將1∶5000稀釋的抗體封閉膜1 h，洗膜6次后將二抗室溫封閉30 min，后再洗膜6次。將發(fā)光底物與膜在室溫下孵育5 min，曝光、顯影。應(yīng)用Phoretix 1D生物電泳圖象分析系統(tǒng)讀每個(gè)條帶的光密度值。

1.3.3.3 肺組織TNF-αmRNA的檢測(cè) TNF-α引物：F 5CGCAAGAGTGTCTGGCGCAA 3，R 5GGATGACGCG GAG ACGGA3，產(chǎn)物長(zhǎng)度145 bp。內(nèi)參β-actin引物：F 5AGGCTGTCTTGTCCTGTA 3，R 5ATGTCACGCCAGATTTCC 3，產(chǎn)物長(zhǎng)度176 bp。采用Trizol法提取肺組織RNA，抽提后的RNA加入溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢驗(yàn)RNA是否降解，在確定無(wú)降解后測(cè)定RNA濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后在ABI7500上擴(kuò)增，得到擴(kuò)增曲線與CT值。采用2-△△CT計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。ONE-WAY ANOVA（單向方差分析）組間數(shù)據(jù)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈血?dú)飧淖兣c常規(guī)潮氣量組比較 大潮氣量對(duì)照組動(dòng)物在創(chuàng)傷后30 min，PaO2顯著降低（P<0.05），并在4 h內(nèi)持續(xù)保持低水平。大潮氣量烏司他丁組動(dòng)物PaO2于30 min先降低，1 h后持續(xù)有所升高，與大潮氣量對(duì)照組比較有顯著升高但低于同時(shí)期常規(guī)潮氣量組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 血清肺組織中TNF-α含量的檢測(cè)結(jié)果 創(chuàng)傷后大潮氣量組血清在TNF-α的含量逐漸升高，烏司他丁組明顯低于對(duì)照組組（P<0.05）。同時(shí)期常規(guī)潮氣量組血清中TNF-α則無(wú)明顯變化，且各時(shí)間段無(wú)明顯變化（P>0.05），見(jiàn)表2。而肺組織中TNF-α的表達(dá)量以大潮氣量對(duì)照組最高為（98.43±2.99）pg/mL，大潮氣量烏司他丁組次之為（89.69±6.38）pg/mL，常規(guī)潮氣量組最低為（75.32±3.21）pg/mL，其他兩組與同時(shí)期常規(guī)潮氣量組比較（P<0.05），其他兩組與同時(shí)期對(duì)照組比較（P<0.05）。

2.3 不同組別肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá) qPCR擴(kuò)增曲線說(shuō)明所采用的體系和條件符合要求（圖1）。同時(shí)，溶解曲線表明為特異性擴(kuò)增（圖2）。肺組織中TNF-αmRNA的表達(dá)以大潮氣量對(duì)照組最高為1，大潮氣量烏司他丁組次之為（0.534±0.033），常規(guī)潮氣量組最低為（0.774±0.042），各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 不同組別肺組織中TNF-α蛋白的表達(dá) 大潮氣量對(duì)照組肺組織中TNF-α蛋白表達(dá)含量最高為（0.843±0.032），大潮氣量烏司他丁組次之為（0.489±0.015），常規(guī)潮氣量組最低為（0.194±0.028），各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

3 討論

呼吸機(jī)所致肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）是由于機(jī)械通氣導(dǎo)致肺損傷的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，病理上顯現(xiàn)為彌漫性肺損傷：肺泡外氣體、肺泡上皮與血管內(nèi)皮的廣泛破壞、肺水腫和肺不張等。VILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜：除氣壓傷、容量傷、肺萎陷傷外，免疫細(xì)胞和炎癥因子介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)也參與其中[7-9]。當(dāng)肺內(nèi)細(xì)胞感知機(jī)械力量刺激后，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)激活炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放大量炎癥因子，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，大量炎癥介質(zhì)釋放，并通過(guò)肺并進(jìn)入血液循環(huán)，最終促進(jìn)和加重SRIS及MOF[10-11]。而其中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TNF-α等炎性介質(zhì)對(duì)啟動(dòng)早期炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的維持起著重要作用[12-14]。

TNF是主要由激活的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的Ⅱ型膜蛋白，可與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等生物學(xué)效應(yīng)的促進(jìn)作用。而在TNF家族中TNF-α不但是炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的啟動(dòng)因子，還可誘導(dǎo)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、受體等合成和表達(dá)。同時(shí)可激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，并相互作用?？傊谑艿竭^(guò)度機(jī)械通氣時(shí)肺泡上皮細(xì)胞受到牽拉而變形，繼而發(fā)生機(jī)械應(yīng)力衰竭，并伴隨胞膜破壞，導(dǎo)致炎性細(xì)胞分泌TNF-α增多，介導(dǎo)了NF-κB信號(hào)通路的活化，最終誘導(dǎo)肺內(nèi)細(xì)胞的凋亡[15-17]。

本研究結(jié)果顯示：VILI損傷模型兔在大潮氣量機(jī)械通氣后，隨著時(shí)間的增加，血清中、肺組織中TNF-α表達(dá)顯著增加，提示其在VILI的發(fā)展過(guò)程中可能起到一定的作用。肺組織TNF-α表達(dá)在VILI的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，烏司他丁對(duì)VILI有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)TNF-α的表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的[18-20]。但是，參與VILI的炎癥因子眾多，TNF-α與其他細(xì)胞因子也有協(xié)同作用，轉(zhuǎn)錄水平的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。烏司他丁對(duì)肺的保護(hù)作用是否還有其他的信號(hào)通路傳導(dǎo)參與，仍需要更進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2016-05-19） （本文編輯：程旭然）