IL—6對結(jié)直腸癌耐藥相關性研究

林琳　龐雄昊　劉愛學　李美香

【摘要】 目的：探討白介素6的表達對結(jié)直腸癌耐藥性的影響。方法：運用RNA過表達技術對原代培養(yǎng)的結(jié)直腸癌患者細胞株進行IL-6的過表達，Western-blot進行過表達的驗證，確保IL-6在細胞中過表達，檢測過表達IL-6和其相應的對照組（mock對照）兩種細胞株的耐藥性，藥物選擇為放線菌素D、阿霉素、5-氟尿嘧啶、羥基喜樹堿、絲裂霉素C、紫杉醇、新長春堿，MTT實驗檢測這些藥物的細胞活力（每個藥物至少5個濃度），敏感度用IC50表示。考慮到實驗的嚴謹性，運用si干擾技術干擾IL-6的過表達，然后檢測干擾和IL-6后耐藥性是否與過表達的細胞株相反。結(jié)果：蛋白印跡結(jié)果檢測IL-6在轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)的結(jié)直腸癌患者細胞株中高表達，利用MTT結(jié)果將其換算成IC50，耐藥性檢測結(jié)果顯示過表達IL-6的結(jié)直腸癌患者細胞株的IC50高于其對照組，尤其a阿霉素和紫杉醇兩種藥物，其IC50相對于對照組分別為152和560倍數(shù)，在干擾后耐藥性檢測其IC50下降。結(jié)論：IL-6過表達可以加速結(jié)直腸癌患者細胞株耐藥性。

【關鍵詞】 結(jié)直腸癌； 耐藥性； IL-6； 相關性分析

Drug-resistent Relativity Analysis of IL-6 in Colorectal Carcinoma Cell/LIN Lin，PANG Xiong-hao，LIU Ai-xue，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（02）：028-031

【Abstract】 To discuss the drug-resistent influence of IL-6 in colorectal carcinoma cell.Method：Overexpression IL-6 in colorectal cancer cells by RNA technology，to make sure IL-6 overexpress，we tested it by Western-blot.The drug-resistent relativity of those cells we tested it by IC50，which conversed by MTT，those drug contains Actinomycin D，Doxorubicin，5-Fluorouracil，Hydroxycamptothecin，Mitomycin C，Paclitaxel，Vincristine.Seriously，we used siIL-6 to explain it on the other hand，and then tested drug-resistent.Result：The result of Western-blot showed that IL-6 was overexpression in colorectal carcinoma cell，IC50，which conversed by MTT，showed that the group of overexpress IL-6 was more higher than that of the control group，especially Doxorubicin and Paclitaxel，the increase 152 and 560 folds，but it become reduce after interfence.Conclusion：IL-6 overexpression in colorectal carcinoma cell can accelerate drug-resistent.

【Key words】 Colorectal carcinoma； Drug-resistent； IL-6； Relativity analysis

First-authors address：Shenzhen No.2 Peoples Hospital，Shenzhen 518037，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.02.008

結(jié)直腸癌以其復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快、侵襲性強、惡性程度高著稱，目前越來越受到科學研究者的關注[1]?，F(xiàn)在市場上用來抵抗結(jié)直腸癌的藥物如阿霉素等為阻斷主要抑制DNA合拓撲異構酶Ⅱ，5-氟尿嘧啶、喜樹堿（CPT）等類似物作用機制獨特主要抑制拓撲異構酶Ⅰ[2-3]。藥物耐藥性已成為臨床上比較棘手的問題，特別是在腫瘤治療方面，關于其耐藥性機制的有關研究已有很多報道，在這些研究報道中研究較多的是MDR1編碼的P糖蛋白，過表達MDR相關的轉(zhuǎn)運蛋白，如P糖蛋白和MRP1會導致腫瘤細胞抵抗化療藥物[4-6]。

細胞因子作為細胞間鏈接的中介物，起到非常重要的作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，體內(nèi)細胞因子的紊亂會導致各種疾病，包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌，有些細胞因子能限制腫瘤細胞的生長，有些則能抑制腫瘤細胞的生長，據(jù)報道細胞因子的失調(diào)與腫瘤的進程有關系[7-10]。

白細胞介素6（IL-6），能使B細胞前體成為產(chǎn)生抗體的細胞，和集落刺激因子協(xié)同，能促進原始骨髓源細胞的生長和分化，增強自然殺傷細胞的裂解功能。最初其發(fā)現(xiàn)在白細胞中發(fā)揮作用，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)在部分骨髓細胞和腫瘤細胞也可以產(chǎn)生和分泌IL-6[11-13]。IL-6作為一種多效應的細胞因子能調(diào)節(jié)細胞各種功能，包括細胞增殖和分化，免疫防疫。也有報道研究表示IL-6與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切，其機制在于通過干預細胞粘附和表面抗原的表達來影響腫瘤的進展[14-17]。但是IL-6在結(jié)直腸癌中的耐藥性問題報到少見，基于此筆者集中在研究IL-6與結(jié)直腸癌耐藥性的關系。現(xiàn)報道如下

1 材料與方法

1.1 細胞株選擇 人結(jié)直腸癌細胞株選自結(jié)直腸癌患者腫瘤原代培養(yǎng)，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中（青霉素和鏈霉素各100 U/mL），置于37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)，25 g/L胰酶消化，實驗用細胞均處于生長對數(shù)期。

1.2 實驗方法

1.2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達的IL-6和低表達的結(jié)直腸癌細胞 將處于對數(shù)期的人結(jié)直腸癌細胞株種于六孔板中，保證每孔細胞量為（3～8）×105，lipo2000加入5 μL用100 μL無血清培養(yǎng)基混勻，靜置5 min，同時過表達IL-6的質(zhì)粒12 μL于100 uL無血清的培養(yǎng)基中混勻，5 min后兩者混勻20 min，然后加入1800 μL的無血清培養(yǎng)基，48 h后提蛋白Western-blot檢測。

1.2.2 蛋白的提取 （1）運用碧云天蛋白試劑盒提取細胞上清蛋白（由于IL-6是外分泌蛋白所以需要提取細胞上清進行蛋白檢測）。（2）用BCA進行定量。按照A液比B液以50∶1的比例進行配置BCA溶液。取收集的細胞上清2 μL，加入18 μL PBS，200 μL AB混合液。（3）將所有蛋白樣品用補足液調(diào)至等濃度，同時加入1X的溴酚藍，占比總體積的1/5。

1.2.2.1 SDS-PAGE 電泳：（1）上樣前將膠板下的氣泡趕走；（2）所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，蛋白上樣量保證在一定濃度上進行，同時加入6 μL蛋白marker；（3）以初始電壓為80 V跑濃縮膠，然后升至120 V跑分離膠；（4）在目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結(jié)束；浸泡PVDF膜：將PVDF膜泡在甲醇中5 min。轉(zhuǎn)膜：切除濃縮膠，將分離膠至于濾紙上，膠的上面為PVDF膜，按順序鋪上膜與每側(cè)1張（干轉(zhuǎn)每側(cè)3張）濾紙。恒流250 mA，90 min，然后將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，TBST稍加漂洗，5%脫脂牛奶封閉液中緩慢搖蕩1 h。TBST稍加漂洗，一抗孵育過夜，第2天將其放在常溫復溫40 min，然后TBST漂洗膜3次，5 min/次。根據(jù)一抗來源選擇二抗，室溫輕搖1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗膜3次，5 min/次。對洗后的PVDF膜發(fā)光顯影，用ECL發(fā)光液進行發(fā)光顯影，配置方法為A液比B液1∶1進行配置，進行發(fā)光顯影。

1.2.2.2 耐藥性檢測 （1）接種細胞：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單細胞懸液每孔1000～10 000細胞接種96孔板每孔體積200 μL。（2）待人結(jié)直腸癌細胞株貼壁后，每孔加MTT（噻唑藍）溶液（5 mg/mL用PBS配制pH=7.4）20 μL。繼續(xù)孵育

4 h終止培養(yǎng)小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液對于懸浮細胞需要離心再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液每孔加150 μL DMSO振蕩10 min使結(jié)晶物充分融解。（3）選擇490 nm波長酶標儀上測定各孔光吸收值記錄結(jié)時間，橫坐標吸光值縱坐標繪制細胞生長曲線。（4）IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的時候藥物的濃度。將藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50%抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。

1.3 試劑 胎牛血清FBS購于Hyclone，MTT配置MTT 0.5 g，溶于100 mL磷酸緩沖液（PBS），用0.22 μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 ℃避光保存即可，siIL-6購于廣州銳博生物公司，IL-6 antibody 購于Santa（SC1269），二抗均購自于北京中衫金橋公司。

1.4 統(tǒng)計學處理 本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包和Sigmaplot軟件分析作圖，采用t檢驗比較各組間是否具有統(tǒng)計學差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌細胞株轉(zhuǎn)染效率檢測 為了構建IL-6過表達和低表達的人結(jié)直腸癌細胞株細胞株，將IL-6過表達的質(zhì)粒按照上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞株，Western-bolt檢測結(jié)果，見圖1。

2.2 過表達的IL-6和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人結(jié)直腸癌細胞株細胞系中耐藥性檢測 將未轉(zhuǎn)染的細胞和轉(zhuǎn)染過表達IL-6的人結(jié)直腸癌細胞株細胞株中進行耐藥性檢測，耐藥性檢測多采取MTT法，取24、48、72 h三個時間點測量在波長570 nm時的吸光度值，見圖2，相比于未轉(zhuǎn)染組IL-6過表達組對腫瘤細胞系起到促進生長作用，表1為各個藥物對兩種細胞系的IC50值，相比來說未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人結(jié)直腸癌細胞株藥物濃度相比轉(zhuǎn)染過表達IL-6的結(jié)直腸癌細胞更高，尤其是阿霉素和紫杉醇兩種藥物。

2.3 沉默IL-6后表達耐藥性檢測 正向?qū)嶒炓呀?jīng)證實在IL-6高表達時人結(jié)直腸癌細胞系的耐藥性增高，但是反向?qū)嶒炍吹玫阶C實，如低表達IL-6的IL-6后耐藥性的檢測。筆者同樣采取MTT增值實驗檢測其對細胞增殖的影響，同理檢測其IC50后發(fā)現(xiàn)之前過表達IL-6時的7種藥物，其IC50均有明顯下調(diào)，見圖3和表2。

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)生率逐年升高。結(jié)直腸癌以其復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快著稱，目前越來越受到科學研究者的關注。在美國，人結(jié)直腸癌細胞株的患病率達到每年4000人，雖然現(xiàn)在醫(yī)療設施的不斷更新，其治療效果也得到明顯改善，但是其耐藥性是困擾廣大醫(yī)生和患者的一個難題，所以解決腫瘤耐藥性對腫瘤的治療時具有重要意義的[18-19]。

細胞因子調(diào)控藥物耐受性的潛在分子機制還未清楚，但是細胞因子可以調(diào)控很多藥物耐受性基因。有研究報道，IL-6、IL-8在很多種腫瘤中有表達，IL-6促進腫瘤的浸潤和藥物抗性的機制是通過上調(diào)X-linked inhibitor of apoptosis（XIAP）來進行。也有報道IL-6能上調(diào)MDR1（multidrug resistance receptor1）的表達，化療藥物不僅能上調(diào)P糖蛋白（P-gp），還能加速IL-6、IL-8的累積，但是IL-6、IL-8如何調(diào)控MDR蛋白的表達還需更進一步的研究[20-21]。

本研究集中在IL-6和人結(jié)直腸癌細胞耐藥性的相關性分析，首先通過基因過表達技術在人結(jié)直腸癌細胞株中過表達IL-6，并由Western-blot檢測，將獲得的IL-6過表達人結(jié)直腸癌細胞株和相應的其對照組檢測放線菌素D、阿霉素、5-氟尿嘧啶、羥基喜樹堿、絲裂霉素C、紫杉醇、新長春堿七中藥物的耐藥性，尤其是阿霉素和紫杉醇兩種藥物，其耐藥性明顯高于對照組。初步得出結(jié)論，IL-6過表達可以加劇人結(jié)直腸癌細胞株耐藥性，再次利用反向?qū)嶒炞C實這一結(jié)果，運用si干擾技術干擾IL-6后再次檢測藥物耐藥性，結(jié)果為與對照組相比，其IC50值均明顯下降，此正反實驗進一步佐證了實驗結(jié)果。

本研究的亮點在于在國內(nèi)較早提出IL-6過表達可以加劇人結(jié)直腸癌細胞株耐藥性，并通過正反實驗證實了這一結(jié)果。其研究弊端在于沒有研究IL-6如何加速人結(jié)直腸癌細胞耐藥性，或則說其研究機制還需更進一步的研究，但是本次研究為后續(xù)的研究提供了基礎。

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（收稿日期：2016-11-11） （本文編輯：程旭然）