多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

郭泉

摘要：目的 進(jìn)行受試制劑多索茶堿緩釋片與參比制劑多索茶堿片在Beagle犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，明確其是否具有緩釋特征，為臨床研究提供依據(jù)。方法 采用兩制劑兩周期交叉試驗(yàn)方法，12只Beagle犬分別經(jīng)口給予受試制劑和參比制劑400 mg，采用LC-MS法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)血漿中多索茶堿的濃度，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)DAS 2.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算獲得。結(jié)果 受試制劑與參比制劑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Cmax分別為（4.9±0.6） 和（8.4±2.1）μg/mL，Tmax分別為（2.5±0.5）和（1.7±0.4）h，T1/2分別為（1.4±0.4）和（1.0±0.3）h，AUC0-12分別為（14.0±1.7）和（14.4±2.9）μg/mL×h。受試制劑在達(dá)峰濃度上明顯小于參比制劑，達(dá)峰時(shí)間延遲，半衰期延長，具有緩釋制劑特征。結(jié)論 受試制劑多索茶堿緩釋片具有緩釋特征。

關(guān)鍵詞：多索茶堿；Beagle犬；藥代動(dòng)力學(xué)；緩釋；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Pharmacokinetic Studies of Doxofylline Sustained Release Tablets in Beagles

GUO Quan

（The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004，Anhui，China）

Abstract：Objective To study the pharmacokinetics of Doxofylline Sustained Release Tablets and Doxofylline Tablet in Beagles. Methods A total of 12 male Beagles were randomly divided into two groups. They were assigned to receive Doxofylline Sustained Release Tablets （trial preparation） and Doxofylline Tablets （reference preparation） respectively. The plasma of Doxofylline were detected by LC-MS method after oral administration of 400mg. The pharmacokinetic parameters were calculated by the procedure of DAS 2.0. Results The Cmax of the two preparations were （4.9±0.6） and （8.4±2.1）μg/mL， Tmax were （2.5±0.5） and （1.7±0.4）h， T1/2 were （1.4±0.4） and （.0±0.3）h， AUC0-12 were （14.0±1.7） and （14.4±2.9）μg/mL*h. Trial preparation was significantly less than reference preparation in the peak concentration， while tmax and half-life was prolonged. Conclusion Doxofylline Sustained Release Tablets （trial preparation） was characterized by slow drug releasing.

Key words：Doxofylline； Beagles； pharmacokinetics； Sustained Release Tablet； LC-MS

多索茶堿（doxofylline）是一種新型平喘鎮(zhèn)咳藥，直接作用于支氣管和肺血管平滑肌，擴(kuò)張支氣管和肺血管。多索茶堿通過抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶起作用，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而松弛平滑肌。高濃度多索茶堿可抑制細(xì)胞內(nèi)組胺的釋放。與傳統(tǒng)藥物茶堿和氨茶堿相比，療效高且毒性低，治療效果是氨茶堿的10～15倍[1-2]。多索茶堿國內(nèi)現(xiàn)有劑型有片劑、膠囊劑和注射劑，均為速釋型制劑，未見緩釋制劑上市，本品多索茶堿緩釋片采用親水凝膠骨架技術(shù)，延緩多索茶堿的釋放，延長多索茶堿在體內(nèi)的半衰期，從而達(dá)到給藥期間有效保持有效血藥濃度，減小血藥濃度峰谷波動(dòng)，增加治療指數(shù)的目的。

該研究參照《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]要求，通過LC-MS法觀察多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)情況，以了解多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內(nèi)吸收規(guī)律，為其進(jìn)一步研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Beagle犬普通級(jí)，10.0～12.0 kg，共12只，雄性，購于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司。

1.2儀器與試劑 LC/MS-2010EV液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q Academic純水機(jī)（上海密理博貿(mào)易有限公司）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HGC-24型氮吹儀（北京瑞邦興業(yè)科技有限公司）；16K平衡離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

多索茶堿緩釋片（規(guī)格：400 mg/片，批號(hào)：20090406，合肥合源藥業(yè)有限公司）；多索茶堿片（規(guī)格：200 mg/片，批號(hào)：081201，黑龍江福和華星制藥集團(tuán)股份有限公司）；多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100625-200301，中國藥品生物制品檢定所購買）；內(nèi)標(biāo)卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100142-199503，中國藥品生物制品檢定所購買）；甲醇（色譜純，Merck公司）、乙腈（色譜純，Merck公司）；乙酸乙酯（分析純，廣東汕頭市西隴化工廠）；水為自制純化水。

1.3方法

1.3.1色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱：Phenomenex Syneryi 4μ POLAR-RP 150×2.0 mm；流動(dòng)相：甲醇∶水（0.1%甲酸）=72∶28（V∶V），流速：0.2 ml/min，柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。質(zhì)譜條件：ESI離子源；CDL Temperature 250℃，Heat Block Temperature 200℃，Detector Voltage 1.7 KV；正離子方式檢測(cè)，掃描方式為選擇離子檢測(cè)（SIM），用于定量的離子分別為多索茶堿m/z：267.0；內(nèi)標(biāo)卡馬西平m/z：237.2，掃描時(shí)間：1.00 s。

1.3.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 12只Beagle犬隨機(jī)分為兩組，采用雙周期兩制劑雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，第一組先服用受試制劑后服用參比制劑，第二組先服用參比制劑后服用受試制劑。服藥前禁食過夜（12 h以上），于給藥當(dāng)日清晨空腹經(jīng)口給予受試制劑多索茶堿緩釋片1片或參比制劑多索茶堿片2片，并用100 ml溫開水灌送，分別于給藥前（0 h）和給藥后10 min、20 min、 30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、 10 h、12 h從犬后肢靜脈取血2 ml，放入試管中，靜置30 min左右，3000 rpm離心15 min，取血漿于離心管中，-70℃冷凍待測(cè)。服藥后2 h可飲水；間隔1 w兩組交叉服藥，第二周期采血時(shí)間點(diǎn)與第一周期相同。

1.3.3樣品處理方法 精密量取血漿100 μl置于空白離心管中，加入內(nèi)標(biāo)卡馬西平溶液（1.515 μg/ml）10 μl，渦旋30 s，再加入1 ml乙酸乙酯，渦旋3 min，14000 rpm離心10 min，提取有機(jī)層，N2下吹干，500 μl流動(dòng)相復(fù)溶，10 μl進(jìn)樣。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 標(biāo)準(zhǔn)曲線采用線性回歸分析，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用DAS 2.0軟件計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1專屬性 取空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，按1.3.3項(xiàng)下操作，獲得空白樣品色譜圖；將一定濃度多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入Beagle犬空白血漿中，同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖；同法得到Beagle犬給藥后血漿樣品色譜圖。多索茶堿保留時(shí)間為4.7 min，內(nèi)標(biāo)卡馬西平保留時(shí)間為4.5 min。在色譜條件下，Beagle犬組織勻漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾多索茶堿及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。血漿典型色譜圖，見圖1。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取不同濃度的多索茶堿及內(nèi)標(biāo)工作液各10 μl，加入不同體積空白血漿，混勻，按1.3.3項(xiàng)下方法處理制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以血漿濃度（Y）為縱坐標(biāo)，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（X）作為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（W=1/X2）進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，在0.026～13.312 μg/ml線性范圍內(nèi)，回歸方程為Y=0.99X+0.003，r=0.99（n=3），定量下限為0.026 μg/ml。

2.1.3 精密度 按1.3.3 項(xiàng)下方法處理制備高、中、低3個(gè)濃度（分別為0.052，0.416和6.656 μg/ml）的多索茶堿樣品，平行操作6份，于同1 d內(nèi)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。不同濃度多索茶堿日內(nèi)精密度RSD分別為0.81%～6.30%；日間精密度RSD分別為3.19%～7.12%，符合要求。

2.1.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按1.3.3 項(xiàng)下方法處理制備高、中、低3個(gè)濃度的多索茶堿樣品，平行操作3份，以處理后的樣品色譜峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)處理的樣品色譜峰面積之比，考察方法的提取回收率；以空白血漿處理后再加入標(biāo)準(zhǔn)溶液所得色譜峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)處理的樣品色譜峰面積之比考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示多索茶堿及內(nèi)標(biāo)提取回收率分別為80.25%～86.67%、81.07%～86.54%，基質(zhì)效應(yīng)分別為80.78%～99.23%、86.20%～96.57%；RSD值均<10%，符合要求。

2.1.5穩(wěn)定性 按1.3.3項(xiàng)下方法處理制備高、中、低3個(gè)濃度的多索茶堿樣品，平行操作，分別考察在室溫放置24 h、室溫放置8 h再處理、反復(fù)凍融3次、長期冷凍66 d條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示RSD值均<10%，樣品在上述條件下均穩(wěn)定。

2.1.6樣品測(cè)定過程中的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)量控制 為減少系統(tǒng)誤差，在進(jìn)行樣品分析時(shí)，每個(gè)分析批均建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，并測(cè)定質(zhì)控樣品（分別為0.052，0.416和6.656 μg/ml），質(zhì)控樣本數(shù)不低于待測(cè)樣本的5%，確保計(jì)算得到的藥物濃度準(zhǔn)確可靠。

2.2 Beagle犬藥代動(dòng)力學(xué)研究 Beagle犬經(jīng)口給予多索茶堿后，受試制劑多索茶堿緩釋片和參比制劑多索茶堿片后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖，見圖2，多索茶堿血藥濃度用DAS 2.0軟件統(tǒng)計(jì)相應(yīng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果，見表1。

血藥濃度-時(shí)間曲線圖（n=12）

注：T：受試制劑多索茶堿緩釋片平均血藥濃度-時(shí)間曲線；R：參比制劑多索茶堿片平均血藥濃度-時(shí)間曲線。

受試制劑和參比制劑的ln（AUC0-12）經(jīng)方差分析表明兩制劑間無顯著性差異，經(jīng)雙向單側(cè)t檢驗(yàn)，兩制劑的[1-2α]置信區(qū)間為87.9%～110.2%，表明多索茶堿緩釋片在吸收程度上具有生物等效性；受試制劑和參比制劑ln（Cmax）經(jīng)方差分析，P<0.05，說明兩制劑間存在顯著性差異，經(jīng)雙向單側(cè)t檢驗(yàn)，兩制劑的[1-2α]置信區(qū)間為51.9%～68.0%，表明多索茶堿緩釋片在達(dá)峰濃度上明顯小于普通片；受試制劑和參比制劑ln（MRT）經(jīng)方差分析，P<0.05，說明兩制劑間存在顯著性差異，受試制劑MRT較參比制劑延長。Tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05，表明兩制劑間存在顯著性差異，符合藥物制劑的特點(diǎn)，受試制劑與參比制劑比較，具有緩釋特征。

3 討論

支氣管哮喘屬于變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬于呼吸內(nèi)科常見病、多發(fā)病，尤其在冬春季節(jié)高發(fā)，嚴(yán)重影響患者呼吸功能呈現(xiàn)晝輕夜重的表現(xiàn)，而對(duì)于支氣管哮喘臨床常用方法就是應(yīng)用支氣管擴(kuò)張劑，擴(kuò)張支氣管以減輕哮喘癥狀[2-3]。近年來，隨著多索茶堿的臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)多索茶堿對(duì)于支氣管哮喘患者來說，患者反應(yīng)療效更好。多索茶堿是茶堿的衍生物，為新型的非腺苷阻斷性支氣管擴(kuò)張劑，大量臨床前藥理毒理試驗(yàn)表明，多索茶堿抗支氣管痙攣?zhàn)饔妹黠@強(qiáng)于茶堿，心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及其它系統(tǒng)的藥理作用明顯低于茶堿[4]。

患者服用多索茶堿普通口服制劑后，多索茶堿口服吸收快[7]，患者體內(nèi)血藥快速上升，經(jīng)體內(nèi)代謝后血藥濃度又快速下降，造成血藥濃度波動(dòng)大，出現(xiàn)明顯的血藥濃度“峰谷”現(xiàn)象，從而影響安全性和療效；必須對(duì)制劑的釋藥速度進(jìn)行控制，否則無法保證治療期間維持有效血藥濃度。在多索茶堿一日總劑量相同的情況下，多索茶堿緩釋片的給藥方案較普通片更易達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度；緩慢釋藥使血藥濃度更加平穩(wěn)，有效血藥濃度持續(xù)時(shí)間長，從而避免了普通制劑的“峰谷”現(xiàn)象。同時(shí)多索茶堿緩釋片的開發(fā)減少了患者的給藥次數(shù)，能明顯提高患者的順應(yīng)性，特別適用于需長期用藥的慢性疾病患者。

多索茶堿普通制劑檢測(cè)多采用液相法[5-6]，在檢測(cè)限方面有一定局限性。本研究采用LC-MS測(cè)定Beagle犬血漿濃度，靈敏度高，最低檢測(cè)濃度可至0.026 μg/ml。文獻(xiàn)中生物樣品預(yù)處理方法多使用二氯甲烷、氯仿提取，毒性大，且氯仿萃取過程中容易發(fā)生乳化。本研究采用乙酸乙酯萃取，降低了有機(jī)試劑的毒性。

本研究中受試制劑多索茶堿緩釋片在Beagle犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究表明受試制劑有一定的緩釋特征，其動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為后續(xù)臨床研究提供了參考依據(jù)，有一定的研究價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則[H]GPT5-1.2005-03.

[2]張曉巖，等.支氣管哮喘的流行病學(xué)及發(fā)病危險(xiǎn)因素[J].中華呼吸和結(jié)核雜志，2007，30（7）：538-541.

[3]張建華.支氣管哮喘的流行病學(xué)及高危因素，實(shí)用兒科臨床雜志，2007，23（4）：241-243.

[4]王文勇，等.治療哮喘新藥多索茶堿[J].黑龍江醫(yī)藥，2001，14（5）：379-380.

[5]顧健，張春燕，曹兆龍，等.多索茶堿片在中國人的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國新藥雜志，2000，9（6）：396-398.

[6]闞全程，李朵璐，師秀琴.HPLC測(cè)定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶堿濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：845-848.

編輯/肖慧