朝鮮婆婆納組織培養(yǎng)與快速繁殖

戴夢璐+林夏珍+肖緯坤+彭安琪

摘要：以朝鮮婆婆納帶腋葉莖為試驗材料，建立以腋芽誘導(dǎo)途徑為基礎(chǔ)的植物組織培養(yǎng)快繁體系。結(jié)果表明：朝鮮婆婆納腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3，接種30 d后腋芽萌發(fā)率可達(dá)83.33%；最適增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，培養(yǎng)30 d后增殖系數(shù)可達(dá)2.87，幼苗生長[JP3]健壯；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA，培養(yǎng)30 d后平均生根數(shù)達(dá)6.85條，平均根長4.67 cm。

關(guān)鍵詞：朝鮮婆婆納；組織培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)；生根培養(yǎng)

中圖分類號： S682.1+90.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0086-03

我國婆婆納屬共有69種（包括亞種、變種）[1-3]，朝鮮婆婆納（Veronica rotunda）為玄參科婆婆納屬植物，是尚未被開發(fā)應(yīng)用的一種極具觀賞價值的草本。朝鮮婆婆納為多年生草本，總狀花序多單生，少復(fù)出，長穗狀，花冠藍(lán)色或藍(lán)紫色，少白色；花期為6—8月，果期為8—11月；分布于中國的遼寧、山西、河南（商城）、安徽（岳西）、浙江（臨安），朝鮮也有分布；生長在山坡草地[3]。目前，有關(guān)朝鮮婆婆納的栽培繁殖報道較少，尤其是組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)尚鮮見報道。本研究可為朝鮮婆婆納的工廠化育苗和將來的遺傳育種研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

朝鮮婆婆納植株于2013年6月在浙江省臨安市清涼峰附近采集。野外采集朝鮮婆婆納后進(jìn)行盆栽，選用第2年萌發(fā)的朝鮮婆婆納的優(yōu)良單株，截取健壯的枝條作為試驗材料。

1.2方法

1.2.1無菌材料的獲得將帶葉腋莖置于適量濃度洗潔精溶液中浸泡10 min，取出洗凈后用流水沖洗1.5 h，并用無菌水潤洗3次，再于超凈工作臺中消毒。消毒方法：先用75%乙醇浸泡15 s，隨后用無菌水沖洗2次，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min（其間不斷晃動），接著用無菌水沖洗5次，所獲得的材料即為無菌外植體。將帶葉腋莖切成1.5 cm左右的小段，接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.2腋芽誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基選擇劉帆等試驗中最常用的MS培養(yǎng)基[4] ，選用6-BA 3個濃度水平（0.5、1.0、2.0 mg/L）、NAA 3個濃度水平（0.1、0.3、0.5 mg/L）、GA3 2個濃度[JP3]水平（0.5、1.0 mg/L），以及不含任何激素的MS培養(yǎng)基，共設(shè)計9種處理（表1），每個處理3次重復(fù)，加對照共30個樣。接種10 d后統(tǒng)計污染率與褐化率，30 d后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率。

1.2.5移栽馴化將根系發(fā)達(dá)、植株比較健壯的瓶苗開蓋煉苗3 d，洗凈植株根部附著的培養(yǎng)基，以多菌靈800倍液消毒，栽種于以下混合配制的基質(zhì)中：（1）蛭石 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]泥炭=1 ∶[KG-*3]1 ∶[KG-*3]1；（2）蛭石 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]泥炭=2 ∶[KG-*3]1 ∶[KG-*3]1；（3）蛭石 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]泥炭=1 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]1。根據(jù)天氣情況定期澆水。每個處理3次重復(fù)，共30個樣，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.2.6培養(yǎng)條件除特殊說明外，基本培養(yǎng)基為MS，添加蔗糖30 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH值為5.8，溫度 （25±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度2 000～2 500 lx[5]。

1.2.7數(shù)據(jù)分析試驗中的所有數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和多重比較[6]。誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出腋芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%；誘導(dǎo)系數(shù)=誘導(dǎo)出的腋芽數(shù)/外植體總數(shù)；增殖系數(shù)=產(chǎn)生的新苗數(shù)/接種苗數(shù)；生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%；平均根數(shù)=總根數(shù)/接種苗數(shù)；平均根長=總根長度/總根數(shù)；成活率=移栽成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素配比對朝鮮婆婆納腋芽誘導(dǎo)的影響

接種7 d后，腋芽明顯膨大（圖1），12 d后部分外植體基部膨大成黃綠色愈傷組織（圖2）。30 d后統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示，腋芽萌發(fā)率最低的培養(yǎng)基為A8，僅為25.56%；4種培養(yǎng)基（A2、A3、A4、A5）的腋芽萌發(fā)率超過60%，其中A5的腋芽萌發(fā)率最高，達(dá)到83.33%，且莖段正常生長，葉片鮮綠色。

由表4可以看出，帶葉腋莖接種到3種激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，誘導(dǎo)率差異顯著，A5誘導(dǎo)效果明顯高于其他激素搭配的誘導(dǎo)效果，所以腋芽誘導(dǎo)無菌苗最佳培養(yǎng)基為1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3。

2.2朝鮮婆婆納的增殖培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)過程中，幼苗在葉基部產(chǎn)生腋芽，同時在基部切口處分化出不定芽，或基部膨大形成愈傷組織，再從愈傷組織分化不定芽（圖3）。由表5看出，9種培養(yǎng)基對增殖效果影響顯著。綜合比較增殖系數(shù)和平均株高，1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為朝鮮婆婆納最佳增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為2.87，平均株高為5.0 cm，且幼苗生長健壯。

2.3朝鮮婆婆納的生根培養(yǎng)

將朝鮮婆婆納無菌苗接種到生根培養(yǎng)基后，培養(yǎng)7 d，幼苗逐漸從基部生出不定根，且切口膨大，慢慢形成凸起（圖4）。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根率、平均根數(shù)和平均根長。結(jié)果表明，不同生長素NAA和IBA濃度組合對朝鮮婆婆納根的形成有較大的影響（表6）。

0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA的組合生根率最高，達(dá)到96.67%（表6）。綜合考慮生根率、平均根數(shù)和平均根長，最佳生根培養(yǎng)基為0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

2.4朝鮮婆婆納的移栽馴化

本研究采用朝鮮婆婆納的帶葉腋莖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究。在腋芽誘導(dǎo)中，細(xì)胞分裂素與生長素的組合有利于腋芽的生成。其中腋芽誘導(dǎo)無菌苗最佳培養(yǎng)基為1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3。朝鮮婆婆納在增殖過程中，細(xì)胞分裂素與生長素的組合雖然能提高無菌苗的數(shù)量，但是增殖系數(shù)并不十分理想，本研究中的最佳增殖培養(yǎng)基增殖系數(shù)也僅為2.87，因此增殖培養(yǎng)基還有待進(jìn)一步研究。在移栽馴化過程中基質(zhì)配比為蛭石 ∶[KG-*3]珍珠巖 ∶[KG-*3]泥炭=1 ∶[KG-*3]1 ∶[KG-*3]1，透氣透水性最好，最利于朝鮮婆婆納的生長，而泥炭基質(zhì)透氣性差，水分不易流失導(dǎo)致根部腐爛，植株死亡。因此，在組織培養(yǎng)試驗中合適的培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件對植物的生長起到重要作用[7-9]

本研究為朝鮮婆婆納無性繁殖提供了一種高效的方法，利用人工栽培有助于擴(kuò)大朝鮮婆婆納的數(shù)量，這種技術(shù)培養(yǎng)的組培苗可用于野生資源的保護(hù)。

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