mTOR抑制劑對大鼠肝癌生長抑制作用的研究

蔡靚羽，張建楠，尹衛(wèi)娟，徐敏逸，趙勁風

（1.南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇無錫214071；2.中南大學湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部納米生物技術重點實驗室，湖南長沙410008）

論著

mTOR抑制劑對大鼠肝癌生長抑制作用的研究

蔡靚羽1，張建楠1，尹衛(wèi)娟2，徐敏逸2，趙勁風2

（1.南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇無錫214071；2.中南大學湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部納米生物技術重點實驗室，湖南長沙410008）

目的探討mTOR抑制劑對大鼠肝癌的抑制作用及其機制。方法將肝癌細胞植入同源大鼠的肝臟，然后用mTOR抑制劑西羅莫司治療4周。用磁共振成像監(jiān)測腫瘤生長情況，通過微脈管密度和血管鑄型等體內實驗及細胞增殖、微管形成及主動脈環(huán)化分析等體外實驗評估西羅莫司抗血管生成和抑癌效果。結果西羅莫司治療組大鼠與對照組相比生存時間明顯延長、腫瘤體積小、肝細胞轉移和腹水少。西羅莫司還降低了瘤內微血管密度并導致腫瘤廣泛性壞死。內皮細胞增殖被抑制所需的西羅莫司濃度低于肝癌細胞。mTOR抑制劑明顯抑制微管形成及動脈環(huán)的血管發(fā)芽新生。西羅莫司治療的腫瘤中血管生成減少，反而出現(xiàn)套疊式血管生成。結論mTOR抑制劑抑制了肝癌細胞生長，并主要通過抗血管生成作用延長了荷瘤大鼠生存期。mTOR抑制劑具有治療肝癌的潛能。

肝癌；西羅莫司；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

肝癌是世界范圍內第5大常見癌癥，是導致死亡的第3大癌癥[1]。肝切除和肝移植仍然是目前肝癌治療的最有效手段，但是僅適用于肝癌早期患者。肝癌系統(tǒng)性化療的效果并不理想，而化療栓塞術等局部治療措施對提高患者生存期作用有限[2]。因此，開發(fā)肝癌治療的新方法和新手段具有十分重要的意義。

肝癌是富血供腫瘤，肝癌切除術后腫瘤內微管脈密度（microvessel density，MVD）可作為是肝癌患者無病生存率預測因子[3]。前瞻性研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高血清含量與腫瘤包膜缺失、腫瘤侵襲和術后復發(fā)密切相關，VEGF是內皮細胞最重要的生長促進因子[4-5]。

JO等[4]研究表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的藥理學抑制劑西羅莫司能夠通過抗血管生成機制抑制腫瘤生長。西羅莫司能夠抑制內皮細胞中VEGF分泌和阻斷VEGF信號通路。mTOR是高度保守的絲氨酸蘇氨酸激酶，并在調節(jié)細胞生長和增殖過程中起重要作用。為應答細胞營養(yǎng)狀況變化和激活其上游PI3k/Akt通路，mTOR通過磷酸化下游靶蛋白磷酸化核糖體S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase，P70-S6K）和翻譯啟動因子4E-結合蛋白1（4E-binding protein 1，4E-BP1），增強mRNA轉錄和蛋白質翻譯。mTOR抑制劑誘導細胞停留在G1期，并阻斷PI3K/Akt介導的增殖信號通路向下游傳導[6]。免疫抑制劑西羅莫司、西羅莫司脂化物（CCI-779）和依維莫司是mTOR抑制劑，并具有抗惡性腫瘤增生和抗血管生成能力[7]。目前這些藥物已用于治療多種腫瘤的臨床試驗[8-9]。本研究肝癌模型中研究了mTOR抑制劑西羅莫司對肝癌增殖和血管生長的影響，以探討西羅莫司在肝癌治療中的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 腫瘤移植及西羅莫司治療

ACI大鼠皮下注射MH肝癌細胞株5×106個，MH肝癌細胞株的來源即為ACI鼠，2周后ACI大鼠皮下形成腫瘤。無菌條件下剝離皮下瘤塊，并剪成1 mm×1 mm×1 mm左右大小，實驗組大鼠肝臟內各植入1塊。腫瘤植入5 d后，開始使用西羅莫司治療。接受治療大鼠單個分籠喂養(yǎng)，根據(jù)大鼠體重，每天在食用水中加入濃度為2 mg/kg的西羅莫司，對照組大鼠食用水中不加西羅莫司。記錄每只大鼠每天的攝入水量及西羅莫司劑量，2 mg/kg的西羅莫司持續(xù)喂養(yǎng)大鼠4周，大鼠植入腫瘤33 d后將其引頸處死，對每只大鼠進行生存評價。收集大鼠血清、全血、腫瘤組織和肝臟。腫瘤體積采用公式：V=4/3× p×r1×r2×r3計算。

1.2 腫瘤生長、壞死及微血管密度檢測

腫瘤植入17 d后進行低場磁共振成像，此后每周進行1次低場磁共振檢測檢測腫瘤生長情況。

高效液相色譜法測量大鼠全血中西羅莫司含量。腫瘤中心壞死，其特點是宏觀劃分的壞死區(qū)周圍可行的腫瘤組織，通過削減腫瘤最大直徑半，測量宏觀可見中央壞死區(qū)域最大直徑和相應的垂直直徑（x，y），評估腫瘤中心壞死。大鼠肝臟瘤內微脈管密度按文獻描述方法進行測量[10]。

1.3 Western blot

取適量（400 mg）腫瘤組織樣品，用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用Bradford法行總蛋白定量。調整每個泳道上樣量為20μg左右。聚丙烯酰胺凝膠電泳：采用5％積層膠和10％分離膠;積層膠電泳電壓為60V，分離膠電泳電壓為120 V，總計電泳時間為2 h左右。將蛋白質轉移至硝酸纖維膜：制作電轉三明治，硝酸纖維膜位于陽極側，凝膠位于陰極側;采用30 V電壓，電轉12 h。將轉有蛋白條帶的膜常規(guī)封閉、洗膜后與兔抗人磷酸化4E-BP1抗體4℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗兔IgG/HRP 37℃孵育4 h。洗膜后ECL顯色。用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)照相，用Quantity One軟件分析，以相應蛋白條帶的灰度值/β-actin蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

1.4 毛細血管形成分析

大鼠大動脈內皮細胞分離后，接種于用基質膠（Matrigel）覆蓋的Lab-Tek腔室培養(yǎng)玻片，加入西羅莫司脂化物（可溶性西羅莫司前體物質）干預細胞，72 h后固定內皮細胞，并用Diff-Quick染色，并用Scion image軟件在40倍的顯微鏡下分析血管長度。

將體重為180～230 g，周齡為8～12周的ACI大鼠胸部主動脈分離，并切成1 mm長寬的小塊。血管置于基質膠（Matrigel）覆蓋的Lab-Tek腔室培養(yǎng)玻片內，并用含10％胎牛血清的F12-K培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用西羅莫司脂化物處理培養(yǎng)血管，對照組加入完全培養(yǎng)基。5 d后，固定血管，并用Diff-Quick染色。

將20μl西羅莫司脂化物溶液（終濃度0.1～1 000 ng/ml）加至脫殼的小雞絨毛尿囊膜。24 h后，在血管中注射0.1 ml的2.5％熒光素異硫氰酸葡聚糖，并檢測絨毛尿囊膜。在熒光顯微鏡下觀察血管形態(tài)，并用CCD攝像頭監(jiān)測微管脈類型。

1.5 胸腺嘧啶脫氧核苷摻入實驗

在2uCi/ml[3H]胸腺嘧啶核苷條件，用濃度為1～1 000 ng/ml的西羅莫司脂化物干預細胞20 h。移去培養(yǎng)基后，細胞用預冷5％三氯乙酸沖洗，然后用0.4 mol氫氧化鈉NaOH震蕩溶解細胞。通過閃爍計數(shù)測量摻入的放射量。每個實驗平行3組獨立3次。1.6流式細胞術期及實時定量qRT-PCR

西羅莫司脂化物溶液（終濃度為0.1～1 000 ng/ml）干預培養(yǎng)6 h后，收集MH細胞和內皮細胞并加入Annexin V-FITC和碘化丙啶。流式細胞儀檢測Annexin V陽性量和碘化丙啶陰性量，分析細胞凋亡情況。

提取腫瘤組織中的總RNA，并在隨機核苷酸混合液中用MMLV反轉錄酶反轉錄。設計并合成特異性正反向引物和熒光探針，在開始定量檢測之前優(yōu)化反應濃度和擴增條件。用18S核糖體RNA作為內參定量分析miRNA表達水平。Δ（Ct）表示達到相同熒光強度所需的PCR循環(huán)數(shù)量。

1.7 血管鑄型

正如先前預測的，肝臟脈管系統(tǒng)用新鮮配制的Mercox溶液灌注，其中每5 ml樹脂中含有0.1 ml的催化劑。灌注1 h后，切除腫瘤，并轉移到15％的氫氧化鉀溶液中浸泡。3～4周后，沖洗鑄型，酒精中脫水，真空干燥器干燥。樣本在金上平鋪為10鈉米作用，掃描電子顯微鏡下檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗，在方差分析有意義的基礎上，采用LSD-t檢驗或SNK-q檢驗進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 西羅莫司在體內對肝癌生長的影響

2 結果

2.1 西羅莫司對腫瘤體積和大鼠生存期的影響

磁共振成像結果表明西羅莫司處理組大鼠腫瘤體積明顯小于對照組大鼠，西羅莫司處理4周后，大鼠處死前，西羅莫司處理組和對照組腫瘤體積分別是（681±142）mm3和（1 643±594）mm3，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=7.642，P=0.001）。西羅莫司處理組大鼠的評價生存期為51.5 d，高于對照組的37.0 d，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=2.289，P=0.002）。見圖1。

2.2 西羅莫司對荷瘤大鼠腫瘤組織壞死和微血管密度的影響

中央壞死組織觀察結果顯示，西羅莫司處理大鼠癌細胞腫瘤平均直徑（7.1±0.3）mm＜對照組（8.6±1.5）mm（t=1.126，P=0.036），而中央壞死組織面積（224±77）mm3＞對照組（149±144）mm3（t= 1.374，P=0.038），中央壞死組織是衡量抗血管生長效果的重要參數(shù)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)有25％的對照組大鼠在實驗結束時血性腹水癥狀，而在西羅莫司處理組則沒發(fā)現(xiàn)。免疫組織化學結果西羅莫司處理大鼠微血管密度（MVD）低于對照組大鼠。見圖2。

2.3 西羅莫司處理對4E-BP1磷酸化的影響

大鼠處死當天，血液中西羅莫司的平均含量為0.7 ng/ml。蛋白質免疫印跡實驗結果表明西羅莫處理組腫瘤細胞中mTOR底物4E-BP1磷酸化程度低于對照組大鼠。見圖3。

2.4 西羅莫司處理對血管形成分析的影響

實時定量PCR結果表明西羅莫司處理組大鼠腫瘤組織中VEGF miRNA的相對表達量為（9.59± 0.35）（n=10），而對照組大鼠腫瘤組織中VEGF miRNA的相對表達量為（8.73±1.21）（n=10），兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=0.947，P=0.041）。

圖2 西羅莫司處理對大鼠腫瘤組織微血管密度的影響

體外實驗主要采用親水性西羅莫司，親水性西羅莫司是酯前體藥物，能夠迅速代謝為西羅莫司。血管形成分析結果表明西羅莫司濃度高于1 ng/ml即可抑制內皮細胞增殖。此外，高于1 ng/ml濃度的西羅莫司還可抑制主動脈環(huán)毛細血管出芽生長，主動脈環(huán)毛細血管出芽生長過程包括內皮細胞、成纖維細胞及血管平滑肌細胞增殖和遷移。濃度高于1 ng/ml發(fā)芽的毛細血管從主動脈環(huán)，包括擴散和遷移的平滑肌細胞和成纖維細胞除了內皮細胞，也被抑制在temsirolimus濃度≥1 ng/ml。雞胚絨毛膜尿囊膜實驗結果證實西羅莫司處理使血管長度下降和出芽點數(shù)量減少。見圖4。

2.5 西羅莫司處理對胸腺嘧啶核苷摻入和凋亡的影響

胸腺嘧啶核苷摻入實驗表明，西羅莫司處理能以劑量依賴的方式抑制內皮細胞增殖，當濃度為1 ng/ml時，西羅莫司就可以有效抑制內皮細胞增殖，而只有濃度達到1 000 ng/ml時，西羅莫司才可抑制MH肝癌細胞增殖（見表1）。其他肝癌細胞株中也得到類似結果（HepG2，Hep3B和Huh7）（見表2）。1 000 ng/ml西羅莫司處理對內皮細胞和肝癌細胞的凋亡率沒有影響。

2.6 西羅莫司處理對血管鑄型的影響

本研究采用血管鑄型掃描電子顯微鏡腫觀察腫瘤內脈管系，結果發(fā)現(xiàn)西羅莫司處理組大鼠腫瘤組織內脈管系統(tǒng)通暢性低于對照組（見圖5A、B），結果提示西羅莫司處理組大鼠新血管形成模式和對照組存在差異，對照組大鼠毛細管叢主要通過出芽方式擴增（見圖5C），而西羅莫司處理組大鼠毛細管叢以套疊方式擴增（見圖5D）。

圖3 西羅莫司處理對4E-BP1磷酸化的影響

圖4 西羅莫司處理對血管形成分析的影響

圖5 西羅莫司處理對血管鑄型的影響

表1 西羅莫司處理對MH肝癌細胞和內皮細胞胸腺嘧啶核苷摻入的比較（ng/ml，±s）

表1 西羅莫司處理對MH肝癌細胞和內皮細胞胸腺嘧啶核苷摻入的比較（ng/ml，±s）

項目基線對照組濃度1101001 000 MH肝癌細胞22.3±1.8100.4±8.9114.7±9.296.4±6.287.3±4.559.2±12.7內皮細胞1.2±0.2100.6±5.752.8±5.357.9±3.639.2±1.722.7±9.5

表2 西羅莫司處理對肝癌細胞和內皮細胞胸腺嘧啶核苷摻入的影響（ng/ml±s）

表2 西羅莫司處理對肝癌細胞和內皮細胞胸腺嘧啶核苷摻入的影響（ng/ml±s）

項目對照濃度1101001 000 HepG2100.1±11.6 93.9±2.795.8±6.197.2±4.356.4±10.8 Hep3B100.5±10.8 92.8±3.894.9±3.299.2±1.662.7±8.2 Huh7100.3±9.294.6±4.995.8±6.498.5±2.171.4±7.9

3 討論

本研究結果表明，mTOR抑制劑可阻礙肝癌進展和提高患者生存期。本研究在肝癌細胞同源大鼠中構建肝癌模型，并采用西羅莫司干預，探討其對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。結果發(fā)現(xiàn)西羅莫司處理組大鼠較對照組腫瘤組織增長緩慢，轉移和血性腹水減少。組織學檢查表面西羅莫司處理組大鼠瘤內微血管密度下降，組織中央壞死面積增大。本研究結果提示mTOR抑制劑主要通過抑制內皮細胞增殖，阻礙腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長，而mTOR抑制劑本身并不能抑制惡性腫瘤細胞增殖。

mTOR抑制劑抑制腫瘤血管生成的可能機制有：增強內皮細胞凋亡敏感性[10]、在腫瘤血管床形成血栓[11]及抑制內皮祖細胞分化等[12]。在本研究中未觀察到細胞凋亡和血栓形成，本研究結果提示其最可能的機制是抑制內皮細胞增殖和芽生式血管生成。細胞增殖實驗表明，MH肝癌細胞mTOR抑制劑抵抗性強于內皮細胞，當西羅莫司濃度低于1 000 ng/ml時，西羅莫司對肝癌細胞無明顯抑制增殖作用，這一結果也在其他類型肝癌細胞株中得到證實。此外，同樣濃度的西羅莫司可以影響主動脈環(huán)血管芽出生長和內皮細胞形成毛細血管，而主動脈環(huán)血管芽出生長涉及血管平滑肌細胞及其周圍毛細血管內皮細胞形成毛細血管則只與內皮細胞相關。雞胚絨毛膜尿囊膜實驗發(fā)現(xiàn)0.1 ng/ml西羅莫司處理就能使血管長度下降和出芽點數(shù)量減少。這些實驗結果提示mTOR抑制劑除了抑制內皮細胞曾，還能影響血管平滑肌細胞和其周圍毛細血管等血管壁支持細胞。

血管出芽生長方式是在原有血管床上形成新血管的經(jīng)典生長方式，血管出芽生長主要依賴內皮細胞增殖及出芽后的管腔形成。本研究采用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，西羅莫司處理組大鼠腫瘤組織血管出芽生長被抑制，這與在內皮細胞中的研究結果一致。西羅莫司處理組大鼠腫瘤組織血管主要以套疊的方式生成。與血管出芽生長方式不同的是，血管套疊生長更少依賴內皮細胞增殖，主要通過毛細血管形成重建微血管系統(tǒng)完成。血管套疊生長會導致原血管腔被分割形成新血管。血管套疊和出芽生長同時存在于腫瘤組織中。

西羅莫司劑量是最大程度抑制腫瘤血管生成的關鍵性因素。研究表明穩(wěn)定維持低濃度西羅莫司能夠達到最好抗血管新生效果，而不是間歇性單次注射[13]。本研究將大鼠體內西羅莫司血清含量維持在1 ng/ml左右的水平，這一濃度移植術后免疫抑制的用量。然而，處理組大鼠微血管密度并沒有明顯下降，但是4e bp1磷酸化程度和VEGF miRNA表達水平下降，結果提示1 ng/ml左右的西羅莫司即可在體內激活VEGF。磷酸化mTOR底物通過損傷VEGF，HIF和Myc等編碼基因miRNA轉錄子的翻譯過程，干擾重要的致瘤信號通路。西羅莫司處理組大鼠腹水減少及VEGF miRNA表達下降正是腫瘤轉移減少的重要原因。

西羅莫司處理延長了荷肝癌大鼠生存期，但不能治愈肝癌。血管鑄型實驗結果表明血管生成并未完全被抑制，而且還出現(xiàn)了套疊生長，這提示該生長方式可能較少依賴mTOR，并有助于腫瘤”逃避”抗血管新生治療。因此可以合理推測，與細胞毒性藥物聯(lián)合使用可以使mTOR抑制劑取得更好的抑癌效果。

總之，本研究結果表明mTOR抑制劑能夠阻礙腫瘤血管生成，誘導血管重建及使肝癌生長受損。

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（張西倩 編輯）

Inhibition of growth of hepatocellular carcinoma in mice by mTOR inhibitor

Liang-yu Cai1,Jian-nan Zhang1,Wei-juan Yin2,Min-yi Xu2,Jin-feng Zhao2
(1.The Affiliated Wuxi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Wuxi,Jiangsu 214071,China;2.Key Laboratory of Nano-biotechnology of Chinese Ministry of Health,Xiangya Hospital,Central South University, Changsha,Hunan 410008,China)

ObjectiveTo investigate the antitumoral effect of mTOR inhibitor on a HCC model.MethodsHepatoma cells were implanted into livers of syngeneic rats.The rats were treated with the mTOR inhibitor Sirolimus for 4 weeks.Tumor growth was monitored by MR imaging.Antiangiogenic effects were assessedin vivoby microvessel density and corrosion casts andin vivoby cell proliferation,tube formation and aortic ring assays.ResultsThe Sirolimus-treated rats had significantly longer survival time,smaller tumors,fewer extrahepatic metastases and less ascites than the controls.Sirolimus decreased intratumoral mic rovessel density resulting in extensive tumor necrosis.The Sirolimus concentration for inhibition of endothelial cell proliferation was lower than that for hepatoma cell inhibition.Microtubule formation and vascular sprouting of aortic rings were significantly impaired by mTOR inhibitor.Vascular casts revealed that Sirolimus significantly reduced vascular formation in tumors,but intussusceptive angiogenesis was observed.ConclusionsmTOR inhibitor significantly reduces HCC growth and prolongs survival time primarily via antiangiogenic effect.Inhibitors of mTOR may have potential in HCC treatment.

hepatocellular carcinoma;Sirolimus;mammalian target of Rapamycin

R735.7

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.006

1005-8982（2017）02-0036-06

2016-02-13