針刺作用及機(jī)械力刺激對(duì)成纖維細(xì)胞的影響*

張小紅,蔡定均,王 宇,黃士其

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610000)

針刺作用及機(jī)械力刺激對(duì)成纖維細(xì)胞的影響*

張小紅,蔡定均△,王 宇,黃士其

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610000)

成纖維細(xì)胞作為穴區(qū)主要的感受性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞，在接受針刺的機(jī)械刺激后其細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、周長(zhǎng)和橫截面積等均會(huì)發(fā)生規(guī)律性改變。同時(shí)機(jī)械力刺激還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、相關(guān)生長(zhǎng)因子的合成與釋放及細(xì)胞骨架重構(gòu)等，這一系列變化的發(fā)生可能與力學(xué)效應(yīng)激活成纖維細(xì)胞膜上的整合素和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，從而導(dǎo)致機(jī)械力作用向生物化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換，由此推斷成纖維細(xì)胞的改變?cè)卺槾痰牧鲗?dǎo)途徑中具有重要的研究意義。

針刺；機(jī)械力刺激；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞骨架；絲裂原活化蛋白激酶

隨著實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步，穴位實(shí)質(zhì)和針灸治療機(jī)理的研究逐漸得到醫(yī)學(xué)界的重視，已從穴位組織、細(xì)胞、分子深入到基因水平。關(guān)于筋膜結(jié)締組織與針刺作用的相關(guān)研究也越來越受關(guān)注。穴區(qū)組織細(xì)胞在接受針刺作用后如何將機(jī)械刺激感知并轉(zhuǎn)換為生物信號(hào)的過程，已成為近年較熱門的研究方向。通過對(duì)針刺信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究，能更科學(xué)充分地闡明針灸治療疾病的途徑與機(jī)制，促進(jìn)針灸在臨床中的廣泛應(yīng)用與傳承。針刺作用于穴位后，根據(jù)針刺部位和深度的不同可將接受刺激的部位分為真皮層致密結(jié)締組織、皮下疏松結(jié)締組織、肌間隔疏松結(jié)締組織、神經(jīng)血管束疏松結(jié)締組織和器官門疏松結(jié)締組織，其中后4種類型均屬于非特異性結(jié)締組織范疇，即筋膜結(jié)締組織[1]。而成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中數(shù)量最多的細(xì)胞，主要由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，具有合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機(jī)基質(zhì)等功能。其對(duì)局部張力變化非常敏感，是主要的感受性細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞。因此，成纖維細(xì)胞在針刺的力信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要意義。

1 成纖維細(xì)胞形態(tài)改變與針刺作用的關(guān)系

細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)是細(xì)胞功能代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，細(xì)胞形態(tài)的改變影響著細(xì)胞功能代謝的完成。針刺作為一種外界的機(jī)械刺激，可被穴位中的成纖維細(xì)胞感知，并引起成纖維細(xì)胞形態(tài)、突起、周長(zhǎng)及橫截面積等改變。通過針刺對(duì)穴位進(jìn)行提插捻轉(zhuǎn)時(shí)，組織位移可發(fā)生顯著變化，尤其在捻轉(zhuǎn)針體時(shí)組織位移可被擴(kuò)大5倍[2]。這種組織牽拉導(dǎo)致了成纖維細(xì)胞在周長(zhǎng)和橫截面積方面發(fā)生顯著時(shí)間、依賴性增長(zhǎng)，牽拉組織中的成纖維細(xì)胞突起更短，“片狀”細(xì)胞體積更大[3]。在激光共聚焦顯微鏡下，30%成纖維細(xì)胞的突起從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞是連續(xù)的[4]。同時(shí)，雙向捻轉(zhuǎn)針刺手法可引起成纖維細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的細(xì)胞擴(kuò)展，形成大量板狀偽足，在捻轉(zhuǎn)兩圈時(shí)該效應(yīng)最明顯，此時(shí)的針刺效應(yīng)可被Rho激酶抑制劑和肌動(dòng)球蛋白收縮等阻斷[5]。通過針刺捻轉(zhuǎn)手法刺激穴位時(shí)，針體對(duì)膠原纖維的牽拉可能引起針體周圍大量成纖維細(xì)胞的可逆性收縮。該種收縮又可進(jìn)一步牽拉膠原纖維，進(jìn)而導(dǎo)致基質(zhì)變形的“波浪”式傳導(dǎo)，最終細(xì)胞收縮將針體機(jī)械力信號(hào)傳導(dǎo)到整個(gè)結(jié)締組織[6]。疏松結(jié)締組織遍布全身，在體內(nèi)形成一個(gè)連續(xù)的網(wǎng)絡(luò),包括皮下和周圍間質(zhì)結(jié)締組織及滲透到肌肉和器官的結(jié)締組織[7]，這可能是針刺循經(jīng)感傳的一種理論支撐。

成纖維細(xì)胞作為穴區(qū)主要的感受性細(xì)胞，對(duì)機(jī)械力刺激的感應(yīng)非常敏感。筋膜組織成纖維細(xì)胞在受到壓力刺激時(shí)，細(xì)胞形態(tài)由原來的梭形變?yōu)槿切危痉植季鶆虻某衫w維細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞發(fā)生回縮，細(xì)胞形態(tài)縮小[8]。人牙周成纖維細(xì)胞在機(jī)械拉伸應(yīng)變作用下，細(xì)胞形態(tài)和骨架均發(fā)生規(guī)律變化，細(xì)胞和細(xì)胞核投影面積與加壓時(shí)間及應(yīng)變值均呈正比[9]。骶韌帶成纖維細(xì)胞在受到拉伸力加載后，結(jié)果顯示加力前細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形，排列呈多向性，無明顯規(guī)律，隨受力時(shí)間延長(zhǎng)，形態(tài)成了單一的長(zhǎng)梭形，排列方向趨于規(guī)則并垂直與最大應(yīng)變方向，以加力24 h最明顯[10]。而針灸的刺法，從微觀角度分析其力學(xué)刺激主要表現(xiàn)為針體機(jī)械運(yùn)動(dòng)過程中針體與周圍組織間的擠壓力、摩擦力和牽張力作用[11]，由此推斷，作為機(jī)械力刺激的一種，針刺作用亦能使穴區(qū)成纖維細(xì)胞發(fā)生相同的效應(yīng)，為日后的研究提供了新的方向和思路。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，針刺引起成纖維細(xì)胞變形，進(jìn)而影響撕裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信號(hào)蛋白的表達(dá)，激發(fā)體內(nèi)一系列生物效應(yīng)[12]?？梢?，成纖維細(xì)胞在感受針刺等機(jī)械刺激及針刺信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用，預(yù)示了針刺的牽拉力和壓力在結(jié)締組織中傳導(dǎo)的形式。

2 成纖維細(xì)胞骨架對(duì)針刺等機(jī)械刺激的響應(yīng)

細(xì)胞骨架是一組由纖維狀結(jié)構(gòu)組成的，位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的一類復(fù)雜的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞外機(jī)制、細(xì)胞膜骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架和細(xì)胞核骨架，狹義的細(xì)胞骨架主要指細(xì)胞質(zhì)骨架，分為微絲、微管、中等纖維以及微梁等結(jié)構(gòu)。其功能為維系細(xì)胞體積和形態(tài)，參與細(xì)胞的力傳導(dǎo)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂和運(yùn)動(dòng)等，其表面含有大量負(fù)電荷，能結(jié)合多種機(jī)械敏感分子，并能調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)信號(hào)分子傳導(dǎo)和離子通道的運(yùn)輸。

針刺作為一種機(jī)械刺激，能對(duì)穴區(qū)組織產(chǎn)生擠壓力、摩擦力和牽張力，這些力分別作用于細(xì)胞后，大部分是由微絲中的F-actin肌動(dòng)蛋白骨架來相應(yīng)。F-actin作為骨架微絲蛋白的主要成分，對(duì)細(xì)胞黏附、鋪展、運(yùn)動(dòng)和內(nèi)吞及分裂等具有重要作用[13]，因其與跨膜分子相連而成為跨膜信號(hào)傳遞的主要環(huán)節(jié)[14]。當(dāng)F-actin受到非破壞性壓力刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生纖維解聚，纖維變細(xì)、變短，排列不一致，在加力12 h時(shí)有所恢復(fù)，破壞性壓力刺激下F-actin解聚，微絲形態(tài)隨加力時(shí)間延長(zhǎng)而遭到不可逆破壞[15]。微絲中的肌動(dòng)蛋白是決定細(xì)胞形態(tài)的最重要骨架蛋白，它通過與肌動(dòng)蛋白集合蛋白發(fā)生反應(yīng)以接受來自細(xì)胞外的刺激并做出應(yīng)答，而α-輔肌動(dòng)蛋白作為細(xì)胞骨架中重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，能使肌動(dòng)蛋白絲和肌動(dòng)蛋白束及肌動(dòng)蛋白網(wǎng)架發(fā)生交聯(lián)，使細(xì)胞骨架微絲進(jìn)一步形成，在適應(yīng)性力作用下α-輔肌動(dòng)蛋白合成可持續(xù)增加[10]。

3 成纖維細(xì)胞整合素對(duì)機(jī)械刺激的響應(yīng)

整合素主要由α、β 2個(gè)亞單位組成，是一類介導(dǎo)細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞黏連的細(xì)胞表面受體。生物細(xì)胞力學(xué)研究表明，細(xì)胞外機(jī)制-整合素-細(xì)胞骨架是細(xì)胞力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑[16]。整合素作為跨膜蛋白在該信號(hào)通路中起到關(guān)鍵的“信號(hào)中轉(zhuǎn)站”作用，主要介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互黏附，以及介導(dǎo)力學(xué)信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)外之間的雙向傳導(dǎo)[17]。壓力是經(jīng)絡(luò)腧穴的有效刺激手段之一，壓力刺激能促進(jìn)筋膜成纖維細(xì)胞力感受器整合素分子α1亞基、α3亞基以及β1亞基的表達(dá)，筋膜成纖維細(xì)胞可通過β1亞基感受壓力學(xué)刺激。研究發(fā)現(xiàn)，整合素β1對(duì)低中度強(qiáng)度的壓力刺激強(qiáng)表達(dá)，對(duì)重度壓力的刺激弱表達(dá)[18-19]，目前認(rèn)為細(xì)胞骨架與信號(hào)分子結(jié)合部位主要是整合素β，α亞基只起調(diào)節(jié)作用。β亞基在機(jī)械力刺激作用下，其“膝部”彎曲以暴露基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，可活化細(xì)胞內(nèi)的黏著斑和RhoGTP酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架構(gòu)的構(gòu)象及活化信號(hào)通路[20]?？缒ぜ?xì)胞黏附分子整合素是大多數(shù)細(xì)胞共有的、關(guān)鍵的力感受器分子，外界刺激可使其發(fā)生空間分子內(nèi)應(yīng)力變化，誘導(dǎo)某種活性結(jié)構(gòu)或功能域的形成，促發(fā)生物化學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以完成力信號(hào)向生物化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)化[21-22]。因此，整合素對(duì)機(jī)械刺激的這種響應(yīng)是否能夠由針刺作用激發(fā)，并以此揭示針刺的力信號(hào)在細(xì)胞中傳遞的機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

4 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路與細(xì)胞骨架的關(guān)聯(lián)性

絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞力信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑，可被一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、炎癥、滲透壓改變及DNA損傷劑等激活。常見MAPK信號(hào)通路有細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、p38MAPK(p38 α,β,γ,δ)及ERK5、ERK7/8和ERK3/4[23]。這些信號(hào)通路能同時(shí)對(duì)微管、微絲和中間纖維等進(jìn)行調(diào)節(jié)。對(duì)微管的調(diào)節(jié)主要有MAPK信號(hào)通路能使MAPs過度磷酸化而間接調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性，其中p38MAPK激酶可通過使鈣離子結(jié)合蛋白中MAP14(S100A9)過度磷酸化來抑制MRP8/MRP14復(fù)合物引起微管多聚化[24]。MAPK對(duì)微絲的調(diào)節(jié)表現(xiàn)在：被激活的ERK、JNK和p38MAPK通路可引起微絲發(fā)生重排及細(xì)胞形態(tài)改變，其中p38MAPK和ERK通路還參與了微絲重排時(shí)細(xì)胞的遷移能力。而p38MAPK還能夠通過影響微絲的完整性和穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和再分化[25-26]。MAPK信號(hào)通道對(duì)中間纖維的調(diào)節(jié)主要有：p38MAPK可通過影響角蛋白的磷酸化狀態(tài)及其在胞內(nèi)的聚合來調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀[27]。同時(shí)p38MAPK/MK2通路還可促使小熱休克蛋白家族中的Alpha B-crystallin蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)中間纖維的穩(wěn)定性[28]。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK和JNK通過激活HSP27蛋白而增強(qiáng)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性[29]。針刺可通過抑制皮膚組織p38MAPK和NF-kB的表達(dá)來降低MMP-1的生成，阻止細(xì)胞外基質(zhì)成分降解而起到抗皮膚衰老的作用[30]。同時(shí)針刺作用能促進(jìn)筋膜組織和脊髓節(jié)段中ERK1/2與p38MAPK的表達(dá)，這不僅說明針刺作用能激活MAPK通道，同時(shí)從側(cè)面證實(shí)了針灸對(duì)人體的作用不僅能通過神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)，還可能存在一種較為原始的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即筋膜結(jié)締組織支架可能在微觀信號(hào)傳遞層面對(duì)局部細(xì)胞分化與增殖有著促進(jìn)作用[11]。

5 其他

此外，針刺作用還可對(duì)成纖維細(xì)胞相關(guān)生長(zhǎng)因子進(jìn)行調(diào)節(jié)。陳波等[31-32]通過模擬毫針壓力刺激作用對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠“足三里”穴筋膜組織成纖維細(xì)胞施壓后，結(jié)果表明壓力刺激能調(diào)節(jié)筋膜組織成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)和前列腺素E2(PGE2)的合成與釋放，并能提高M(jìn)MP-1與TIMP1的比值。同時(shí)在200kPa壓力刺激時(shí)，成纖維細(xì)胞干擾素-β(INF-β)含量顯著降低，而腫瘤壞死因子(TNF-α)合成釋放量明顯增高。由此推斷，毫針的機(jī)械刺激作用可能是通過調(diào)節(jié)穴區(qū)成纖維細(xì)胞相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)來轉(zhuǎn)換成生物信號(hào)的。同時(shí)，通過電針刺激創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)面尤其是負(fù)極在傷口正中時(shí)，能加速創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的形成，從而促進(jìn)傷口的快速愈合[33]。間歇性機(jī)械牽張力能促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖，在1000ustrain和2000ustrain時(shí)表現(xiàn)明顯[34]，而12%形變率、0.2 Hz頻率的牽張力對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增值效果最佳[35]。

綜上所述，當(dāng)壓力、牽張力等力學(xué)刺激作用于穴區(qū)后，可能通過影響成纖維細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)，改變成纖維細(xì)胞骨架中微絲的形態(tài)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞整合素及相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中的JNK、p38MAPK及ERK等信號(hào)通道，來實(shí)現(xiàn)機(jī)械力信號(hào)向生物化學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)。提示成纖維細(xì)胞在力效應(yīng)傳導(dǎo)的過程中起著重要作用，尤其是細(xì)胞骨架作為連接介質(zhì)，其發(fā)生改變是機(jī)械力信號(hào)傳導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)之一。由此推測(cè)，針刺作用屬于力學(xué)刺激的一種，同樣能通過以上方式將刺激作用轉(zhuǎn)換為生物化學(xué)信號(hào)，傳至全身起到治病救人的效果。但目前的研究多以理論推斷和科學(xué)印證為主，其中又以模擬針刺力刺激的研究居多，如何通過對(duì)針刺力信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，揭示力信號(hào)在成纖維細(xì)胞中的傳導(dǎo)規(guī)律，更全面地揭示針刺效應(yīng)的產(chǎn)生與成纖維細(xì)胞骨架、MAPK信號(hào)通路及相關(guān)生長(zhǎng)因子等之間的關(guān)系和機(jī)制，是未來研究中需要面對(duì)和克服的問題，這對(duì)于針灸臨床效應(yīng)的提高有著不容忽視的重要性。

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Effect of Fibroblasts Stimulated by Acupuncture and Mechanical Stress

ZHANG Xiao-hong, CAI Ding-jun△, Wang-Yu, HUANG Shi-qi

(ChengduUniversityoftraditionalchinesemedicine,chengdu610000,sichuan,china)

As the main receptor and effector cell of acupoint, the fibroblasts which stimulated by acupunture and some mechanical force will change in cellular forms,perimeter and cross-sectional area regularly. Acupuncture action is a kind of mechanical force，and the mechanical Strains can promote fibroblasts proliferation, compound and release some growth factors,even refactor cytoskeleton. This series of changes may be associated to the mechanical effect, and the integrin and MAPK signal transduction pathway of the fibroblasts can be actived by mechanical force.Thereby, this process results in mechanical force transform to biological chemical signals.It can be concluded that the change of the fibroblastse has important research significance in acupunture force signal transfer pathway.

Acupunture; Mechanical Strain; Fibroblasts; Cytoskeleton; MAPK

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373559)-經(jīng)穴反應(yīng)性時(shí)間特征的嘌呤信號(hào)—成纖維細(xì)胞

張小紅(1989-)，女，四川遂寧人，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸時(shí)間效應(yīng)及其機(jī)制的研究。

△通訊作者：蔡定均(1975-)，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事針灸時(shí)間效應(yīng)及其機(jī)制的研究，Tel:13558620019,E-mail:1325581717@qq.com。

R224.1

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1006-3250(2017)03-0380-04

2016-08-10