熟地寄生壯骨方對大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型抗炎及保護(hù)軟骨作用的實(shí)驗(yàn)研究*

林潔華,周穎燕,徐偵雄,何曉紅,陳更新,陳玉興, 趙自明, 何羿婷△

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510120；2. 廣東省中醫(yī)院風(fēng)濕科，廣州 510120；3. 廣東省中醫(yī)院新藥開發(fā)辦，廣州 510120；4.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣州 510120)

熟地寄生壯骨方對大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型抗炎及保護(hù)軟骨作用的實(shí)驗(yàn)研究*

林潔華1,周穎燕1,徐偵雄2,何曉紅2,陳更新3,陳玉興4, 趙自明4, 何羿婷3△

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510120；2. 廣東省中醫(yī)院風(fēng)濕科，廣州 510120；3. 廣東省中醫(yī)院新藥開發(fā)辦，廣州 510120；4.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣州 510120)

目的：觀察熟地寄生壯骨方對大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型的影響，探討其抗炎及保護(hù)軟骨作用。方法：采用創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，切取病變膝關(guān)節(jié)制備膝關(guān)節(jié)勻漿液，測定給藥前后一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的含量；病變膝關(guān)節(jié)組織病理切片，按Mankin骨關(guān)節(jié)炎組織分類法進(jìn)行評分。結(jié)果：與空白組比較, 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量顯著增大，大鼠膝骨關(guān)節(jié)Mankin評分值顯著增大；與模型組比較, 熟地寄生壯骨方各組NO、TNF-α含量均明顯減小，大鼠膝骨關(guān)節(jié)Mankin評分值均明顯減小。結(jié)論：熟地寄生壯骨方能降低創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量及改善其軟骨形態(tài)，達(dá)到控制炎癥及保護(hù)軟骨的目的。

創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎；模型；熟地寄生壯骨方；抗炎；軟骨形態(tài)

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(Post-traumatic osteoarthritis) 是骨關(guān)節(jié)炎的常見類型之一[1]，是由創(chuàng)傷引起的以關(guān)節(jié)軟骨退化變性和繼發(fā)軟骨增生、骨化為主要病理變化，以關(guān)節(jié)疼痛、活動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的一種疾病[2]。近年來, 隨著外傷、交通事故的增多，關(guān)節(jié)軟骨的損傷概率增大，創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有增加趨勢[3]。至今人們對軟骨損傷后的自然演變過程還不夠了解，創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎屬于“氣滯血瘀”“風(fēng)寒濕痹阻”痹癥范疇。熟地寄生壯骨方以祛瘀通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕為法，扶正驅(qū)邪、補(bǔ)中寓通使氣血合而筋骨通，肝腎強(qiáng)而痹痛愈，臨床應(yīng)用多年療效確切。本研究以觀察熟地寄生壯骨方對創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的影響為目的，進(jìn)一步尋求熟地寄生壯骨方治療創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

熟地寄生壯骨方提取物(熟地、桑寄生、骨碎補(bǔ)、蘇木、海風(fēng)藤)由廣東省中醫(yī)研究所制劑研究室提供。使用時(shí)按劑量以蒸餾水配制成所需濃度，4℃冰箱保存。必理通(對乙酰氨基酚片)，中美天津史克制藥有限公司(批號11012605)；壯骨關(guān)節(jié)丸，三九醫(yī)藥股份有限公司(批號1103111S)。

1.2 試劑

甲醛，廣州化學(xué)試劑廠(批號20120811-1)；一氧化氮(NO)試劑盒,南京建成生物工程研究所提供(批號20130614)；TNF-α ELISA試劑盒，上海西唐生物科技有限公司(批號20130103)；無水乙醇，天津化學(xué)試劑科貿(mào)公司(批號20120714)。

1.3 儀器

JJ3000動物電子秤，G&G公司產(chǎn)品；BS224S電子天平(1/萬)，德國SARTORIUS產(chǎn)品；YD62 型石蠟包埋機(jī)，浙江金華益迪產(chǎn)品；Leica RM2235輪式切片機(jī)，德國萊卡公司產(chǎn)品；Leica TP 1020型全自動脫水機(jī)，德國萊卡公司產(chǎn)品；YD-AB型攤烘烤片機(jī)，浙江金華益迪產(chǎn)品；YD-6L型智能冰凍包埋機(jī)，浙江金華益迪產(chǎn)品；Shandon Gemini染色機(jī)，德國Thermo公司產(chǎn)品；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.4 動物

SPF級SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2008-0002，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號№44007200002932)。動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境:廣東省中醫(yī)研究所SPF級動物實(shí)驗(yàn)室(設(shè)施使用許可證號SYXK(粵)2010-0059)。

2 方法

2.1 動物分組

取SPF級SD大鼠70只雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、必理通片組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、熟地寄生壯骨方高、中、低劑量組7組。

2.2 劑量設(shè)置

參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算動物臨床等效劑量，并以此作為大鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量。必理通片大鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量為0.270 g/kg，壯骨關(guān)節(jié)丸大鼠藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量為1.080 g/kg，熟地寄生壯骨方處方量為155 g生藥，等效劑量為13.950 g/kg，考慮給藥濃度和給藥體積，設(shè)計(jì)熟地寄生壯骨方大鼠藥效學(xué)高劑量為27.900 g/kg，中劑量為13.950 g/kg，低劑量為6.975 g/kg(分別為2倍臨床等效劑量、臨床等效劑量、1/2臨床等效劑量)。實(shí)驗(yàn)時(shí)以蒸餾水按劑量配制成所需濃度，4℃冰箱保存。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.4 給藥方法

熟地寄生壯骨方各劑量組及陽性對照藥按劑量灌胃給藥，給藥體積10 ml/kg，每天1次，對照組同法灌胃給予蒸餾水10 ml/kg。

2.5 測定方法

除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠均采用切除內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板法(膝內(nèi)關(guān)節(jié)炎經(jīng)典動物模型-Hulth 模型)復(fù)制大鼠創(chuàng)傷性膝骨節(jié)炎模型，正常對照組切開后不切除內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，術(shù)后連續(xù)3 d青霉素20萬U肌肉注射,1周后各給藥組開始給藥，正常對照組、模型對照組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)8周。末次給藥后1 h處死大鼠，取同部位病變膝關(guān)節(jié)，大體觀察后小心切取小塊同部位病變膝關(guān)節(jié)，仔細(xì)去除骨頭和皮膚稱重，在冰浴下以電動研磨器制作 20 %勻漿液，2000 r/min 離心 10 min取上清液，采用 ELISA 法測定NO、TNF-a含量。取同部位病變膝關(guān)節(jié)組織常規(guī)固定、脫鈣、包埋、封片、染色，光鏡觀察后按Mankin骨關(guān)節(jié)炎組織分類法進(jìn)行評分。

3 結(jié)果

3.1 熟地寄生壯骨方對創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量的影響

表1顯示，與空白對照組比較, 模型對照組大鼠膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量顯著增大(P<0.01)；與模型對照組比較, 熟地寄生壯骨方高、中、低劑量組大鼠膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量均明顯減小(P<0.01)。

3.2 熟地寄生壯骨方對創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝骨關(guān)節(jié)Mankin評分的影響

表1顯示，與空白對照組比較, 模型對照組大鼠膝骨關(guān)節(jié)Mankin評分值顯著增大(P<0.01)；與模型對照組比較, 熟地寄生壯骨方高、中、低劑量組大鼠膝骨關(guān)節(jié)Mankin評分值均明顯減小(P<0.01)。

3.3 熟地寄生壯骨方對創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝骨關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響

空白對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,4層結(jié)構(gòu)清晰可辨,軟骨細(xì)胞排列整齊呈柱狀,潮線完整,染色質(zhì)分布均勻,細(xì)胞核清晰,深染均勻(圖a)。

模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨層變薄、粗糙,結(jié)構(gòu)不易分辨,部分區(qū)域軟骨細(xì)胞核固縮、壞死,偏于一側(cè),鈣化層軟骨細(xì)胞呈簇狀,軟骨細(xì)胞排列紊亂,潮線多不完整或完全消失,甚至軟骨下骨質(zhì)外露、軟骨下骨囊變的形成(圖b)。

表1 對創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量及Mankin評分的影響±s)

注：與正常對照組比較：**P<0.01；與模型對照組比較：##P<0.01

熟地寄生壯骨方高、中、低劑量和陽性藥必理通片、壯骨關(guān)節(jié)丸等治療組在病變發(fā)生率、病變范圍和病變嚴(yán)重程度方面與模型組比較均有降低或減輕，膝關(guān)節(jié)軟骨組織在變性、簇聚和壞死方面均輕于模型組(圖c-g)。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理形態(tài)比較(HE 染色 ×400)

3 討論

Hulth 法模型為膝內(nèi)關(guān)節(jié)炎經(jīng)典動物模型[5]，主要方法是麻醉后將動物膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶切斷，切除內(nèi)側(cè)半月板，術(shù)中避免損傷關(guān)節(jié)軟骨，術(shù)后不固定傷肢，動物可自由活動，此方法借手術(shù)形成關(guān)節(jié)不穩(wěn)從而誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎。半月板切除后會導(dǎo)致關(guān)節(jié)的不合槽運(yùn)動，由于動物膝關(guān)節(jié)的正常力學(xué)軸線遭破壞，關(guān)節(jié)最大壓力承受面由正常的外側(cè)脛骨平臺轉(zhuǎn)至內(nèi)側(cè)脛骨平臺與股骨內(nèi)髁，加之韌帶的破壞引起關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，局部關(guān)節(jié)軟骨所承受的壓力相對增加，從而促使關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生變性[6]。Hulth 法模型誘導(dǎo)成功率高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用廣泛，特別適用于膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物預(yù)防和減輕軟骨病理改變的研究[7]。Welch等[8]發(fā)現(xiàn)，單純切除內(nèi)側(cè)半月板前角的大鼠膝關(guān)節(jié)在6周內(nèi)無明顯改變，12 周后關(guān)節(jié)評分有顯著改變；而同時(shí)內(nèi)側(cè)半月板部分切除模型中，6 周時(shí)即發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)評分顯著增加。本研究通過切除內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板法復(fù)制大鼠創(chuàng)傷性膝骨節(jié)炎大鼠模型，造模后模型組膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量及Mankin評分值顯著增大，且各給藥組與模型對照組比較，給藥前膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量及Mankin評分值均無明顯差異，提示Hulth 法創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型造模成功。

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝的主要因子，是參與OA 發(fā)病進(jìn)程中的重要介質(zhì)[9]。另外，TNF-α能激活I(lǐng)L-6基因，誘導(dǎo)IL-6生成，產(chǎn)生進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)；又有學(xué)者報(bào)道， TNF-α主要影響滑膜炎癥和免疫學(xué)反應(yīng)，能誘發(fā)抗自身軟骨的自身免疫反應(yīng)[10]。還有研究表明，TNF-α是主要的炎性細(xì)胞因子，已有報(bào)道OA患者的滑膜內(nèi)存在著高濃度的TNF-α，TNF-α能激活多型核細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2，促進(jìn)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶合成和分泌，引起關(guān)節(jié)軟骨吸收、降解和破壞[11]。熟地寄生壯骨方可以明顯減少膝骨關(guān)節(jié)TNF-α含量，從而達(dá)到抗炎、保護(hù)軟骨的作用，起到治療創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。

一氧化氮與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12-13]。正常情況下, 一氧化氮起宿主防疫作用, 但過量的一氧化氮可導(dǎo)致各種慢性炎癥[14],增高的一氧化氮可協(xié)同各種細(xì)胞因子作用于關(guān)節(jié)軟骨[15]。在關(guān)節(jié)炎時(shí)兩者相互協(xié)同作用, 使病情加重, 阻斷這一惡性循環(huán)的過程可以減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷, 減輕病情。多項(xiàng)研究表明, 創(chuàng)傷性軟骨退變與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Hashimoto等[16]研究認(rèn)為, NO 可能介導(dǎo)創(chuàng)傷后軟骨細(xì)胞的凋亡。熟地寄生壯骨方可以明顯地降低膝關(guān)節(jié)一氧化氮的含量，打破其惡性循環(huán)，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎屬于痹癥范疇， “氣滯血瘀”“風(fēng)寒濕痹阻”證為多見，病機(jī)為腎氣不足、風(fēng)寒濕邪侵入骨骼，或跌仆閃挫，傷損骨骼，以致氣血瘀滯，運(yùn)行失暢，筋骨失養(yǎng)，久之肌萎筋縮、骨節(jié)凝滯。熟地寄生壯骨方以祛瘀通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕為法，扶正驅(qū)邪，補(bǔ)中寓通，使氣血足而筋骨通，肝腎強(qiáng)而痹痛愈，針對創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎病因病機(jī)，臨床應(yīng)用多年療效確切。

本研究在創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型造模成功的基礎(chǔ)上，探討熟地寄生壯骨方對創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。研究結(jié)果提示，熟地寄生壯骨方明顯降低大鼠膝骨關(guān)節(jié)NO、TNF-α含量，還可減輕模型組軟骨病變發(fā)生率、病變范圍和病變嚴(yán)重程度，改善軟骨組織的變性、簇聚和壞死病變。Mankin評分亦說明，熟地寄生壯骨方可改善創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的軟骨病理損害，并證實(shí)熟地寄生壯骨方有抗炎及改善軟骨退變、保護(hù)軟骨的作用，為臨床治療創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Shudi Jisheng Zhuanggu Decoction on anti-inflammatory and Morphology of Articular Cartilage of Knee Post-traumatic Osteoarthritis Model Rats

LIN Jie-hua1, ZHOU Ying-yan1, XU Zhen-xiong2, HE Xiao-hong2, CHEN Geng-xin3, CHEN Yu-xing4, ZHAO Zi-ming4, HE Yi-ting3△

(1.TheSecondClinicalMedicalCollegeofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 2.Dept.ofRheumatism,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China; 3.Dept.ofNewDrugDevelopment,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicineGuangzhou510120,China; 4.GuangdongProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120，China)

Objective: To observe the anti-inflammatory effect and the morphology change of articular cartilage under intervention of Shudi Jisheng Zhuanggu decoction (SJZ) in knee post-traumatic osteoarthritis model rats. Methods: Rats were removed the medial collateral ligament and the medial meniscus to build models of knee post-traumatic osteoarthritis(Hulth’s modeling method)before administration of drugs. Prepared 20% homogenization buffer of the knees to measure the contents of nitric oxide (NO) and TNF-α.Histologic sections of cartilage were received HE staining and Gemini staining were evaluated according to Mankin cartilage histological score. Results: Mankin score and the contents of NO and TNF-α were significantly increased in model group compared to control group. Mankin score and contents of NO and TNF-α of SJZ groups were significantly decreased compared to model group. Conclusion: SJZ can control inflammation and ameliorate morphology of articular cartilage in rats with knee Post-traumatic osteoarthritis, so as to protect the cartilage and delay cartilage degeneration.

Knee post-traumatic osteoarthritis; Model; Shudi Jisheng Zhuanggu decoction; Anti-inflammation； Morphology of cartilage

廣東省科學(xué)技術(shù)廳—廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合科研專項(xiàng)(2011B032200016)-熟地寄生壯骨方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的組方優(yōu)化研究

林潔華(1990-)，女，廣東揭陽人，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥風(fēng)濕病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

△通訊作者：何羿婷，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥風(fēng)濕病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，Tel：020-81887233-39402，E-mail：yitinghe@126.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)03-0411-04

2016-09-15