過敏性紫癜患兒Th17、Treg細胞及IL-17、IL-23水平的測定①

張婷婷 吉曉菲 李少遊 趙 波 段 江 熊晶晶 劉 梅 黃永坤

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，昆明650032)

過敏性紫癜患兒Th17、Treg細胞及IL-17、IL-23水平的測定①

張婷婷 吉曉菲②李少遊 趙 波③段 江 熊晶晶 劉 梅 黃永坤

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，昆明650032)

目的：觀察過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)患兒急性期及恢復(fù)期Th17、Treg細胞及IL-17、IL-23水平變化，以便更好地認識HSP的免疫學(xué)發(fā)病機制，為HSP的治療提供幫助。方法：采用流式細胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測HSP患兒65例和健康對照組兒童30例外周血中Th17細胞和Treg細胞比例；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定其血漿中IL-17、IL-23水平。結(jié)果：HSP急性期組Th17、Th17/Treg細胞及IL-17、IL-23水平高于正常對照組(P<0.05)，恢復(fù)期組較急性期組降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)。HSP急性期組Treg水平低于正常對照組(P<0.01)，恢復(fù)期組較急性期組升高(P<0.01)，但是仍低于正常對照組(P<0.01)。單純型、腹型和其他類型HSP患兒Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-23水平相同(P>0.05)。HSP急性期患兒Th17細胞比例與IL-17水平呈正相關(guān)(r=0.880，P<0.01)；HSP急性期患兒IL-23水平與Th17細胞比例、IL-17水平呈正相關(guān)(r=0.838或r=0.877，P<0.01)。結(jié)論：Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17和IL-23共同參與HSP的發(fā)病，但在單純型、腹型和其他類型中的水平無明顯差異，值得深入研究。

過敏性紫癜；兒童；Th17細胞；Treg細胞；IL-17；IL-23

過敏性紫癜又稱亨-舒綜合征(Henoch-Schonlein purpura，HSP)，是兒童時期較常見的一種自身免疫性血管炎性疾病。好發(fā)于春秋季節(jié)，常伴有上呼吸道感染病史，預(yù)后一般良好但易復(fù)發(fā)，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1,2]。目前大量研究證實，HSP的發(fā)病與免疫紊亂有關(guān)。Th17細胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的不同于Th1、Th2細胞的效應(yīng)性CD4+T細胞亞群，主要通過分泌大量的IL-17和IL-22促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[3]，在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Treg細胞是體內(nèi)一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊T細胞亞群，對維持機體免疫平衡狀態(tài)起重要作用[4]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg細胞失衡與自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等關(guān)系密切[5-8]。Th17細胞特征的穩(wěn)定和維持主要通過IL-23來實現(xiàn)[9,10]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-23/IL-17軸在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化及炎癥性腸病等多種自身免疫性疾病的發(fā)病中具有重要作用[11]。本研究通過觀察HSP患兒Th17、Treg、Th17/Treg以及IL-17、IL-23水平變化，以便更好地認識HSP的免疫學(xué)發(fā)病機制，為HSP的治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 HSP急性期組35例，為2014年4～7月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科及昆明市兒童醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診斷為HSP的住院患兒，年齡3～13歲，平均8.31歲，男22例，女13例，其中，單純型：以皮膚紫癜為主要表現(xiàn)者13例；腹型：以消化道癥狀腹痛、血便或糞便檢查潛血陽性為主要表現(xiàn)者8例；其他型：除單純型和腹型外，共14例。HSP恢復(fù)期組30例，為急性期患兒經(jīng)治療后臨床癥狀緩解，皮膚紫癜明顯減少或無新出紫癜，腹痛、關(guān)節(jié)腫痛等癥狀消失，血尿、蛋白尿減輕或消失，糞便檢查潛血陰性，年齡4～13歲，平均8.65歲，男19例，女11例。診斷均符合1990年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的HSP的診斷標準[12]，均為初次發(fā)病，住院前未使用過腎上腺皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑及細胞毒性藥物等。正常對照組30例，同期體檢的健康兒童，年齡4.5～13歲，平均8.56歲，男17例，女13例。既往無腎臟疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病史，近期無明確感染征象。所有受試對象均知情同意并經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會討論通過。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.356、F=0.132，P> 0.05)。

1.1.2 試劑與儀器 鼠抗人CD3-APC-H7、鼠抗人CD8-FITC、鼠抗人IL-17A-Alexa Fluor? 647、鼠抗人FoxP3-PE、流式細胞儀FACSCantoTMⅡ均購自美國BD公司。IL-17 ELISA試劑盒、IL-17 ELISA試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司，Multiskan MK3酶標儀購自芬蘭Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血Th17細胞檢測 取300 μl肝素鈉抗凝血加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基900 μl的培養(yǎng)瓶中，加入刺激劑和蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑混合液2 μl，移至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。將刺激培養(yǎng)后的全血細胞移至離心管中，加入鼠抗人CD3-APC-H7 5 μl、鼠抗人CD8-FITC 20 μl，室溫避光孵育30 min。加2 ml PBS沖洗，室溫3 000 r/min離心7 min，盡量移去上清液。加1 ml 1×Fix/Perm液，室溫避光孵育40～50 min，加2 ml 1×Perm/Wash液，離心洗滌2次，盡量移去上清液后平均分為兩管，并標記為試驗管和對照管，試驗管加入鼠抗人IL-17A-Alexa Fluor? 64 720 μl，對照管加入同型對照抗體20 μl，室溫避光孵育40～50 min。加2 ml 1×Perm/Wash液，離心洗滌2次，去上清液后加350 μl PBS，重懸沉淀，24 h內(nèi)上機檢測。

1.2.2 外周血Treg細胞檢測 Treg細胞的檢測采用未經(jīng)刺激培養(yǎng)的全血細胞，步驟及方法同上。

1.2.3 血漿IL-17、IL-23測定 采集肘靜脈血約2～3 ml至肝素鈉抗凝管中，留取標本30 min內(nèi)分離血漿，1 500 r/min離心8 min，用移液槍將血漿移至EP管中，編號置-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血漿中IL-17、IL-23濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組兒童Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-23的測定 HSP急性期組Th17、Th17/Treg及IL-17、IL-23水平高于正常對照組(P<0.05)，恢復(fù)期組較急性期組降低(P<0.05)，但是仍高于正常對照組(P<0.05)，HSP急性期組Treg水平低于正常對照組(P<0.01)，恢復(fù)期組較急性期組升高(P<0.01)，但是仍低于正常對照組(P<0.01)。見表1，Th17、Treg流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖1、2。

2.2 各型HSP患兒Th17、Treg、 Th17/Treg及IL-17、IL-23的測定 單純型、腹型和其他類型HSP 患兒Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17、IL-23水平相同(P>0.05)。見表2。

GroupsNormal(n=30)Acute(n=35)Recovery(n=30)Th17(%)066±026135±0461)103±0351)3)Treg(%)315±067181±0462)234±0532)4)Th17/Treg021±007075±0221)046±0171)3)IL?17(pg/ml)1686±6223458±9011)2737±9781)3)IL?23(pg/ml)1835±8133540±13001)2813±12271)3)

Note：Compared with normal children,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with acute phase,3)P<0.05,4)P<0.01.

GroupsSimplex(n=13)Abdominal(n=8)Other(n=14)Th17(%)1)121±033128±055151±048Treg(%)1)171±038181±048191±053Th17/Treg1)072±014073±029080±024IL?17(pg/ml)1)3137±8163290±7263853±969IL?23(pg/ml)1)3038±9833643±14303948±1412

Note：One-way ANOVA,1)P>0.05.

圖1 Th17細胞流式細胞術(shù)檢查結(jié)果示意圖Fig.1 Flow cytometry examination result diagrams of Th17 cell

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果 HSP急性期患兒Th17細胞比例與IL-17水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.880，P<0.01)。HSP急性期患兒IL-23水平與Th17細胞比例或IL-17水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.838或r=0.877，P<0.01)。

圖2 Treg細胞流式細胞術(shù)檢查結(jié)果示意圖Fig.2 Flow cytometry examination result diagrams of Treg cell

3 討論

Th17細胞和Treg細胞是近年新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，它們在維持機體免疫平衡中具有十分重要的作用。HSP被認為是一種全身性炎癥疾病。然而，具體的炎性發(fā)病機制仍不清楚。目前，大量文獻報道過敏性疾病及自身免疫性疾病中Th17細胞及IL-17水平異常升高[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP急性期患兒Th17細胞比例、IL-17水平與正常兒童相比明顯升高，且Th17細胞比例與IL-17水平呈正相關(guān)，與范秋霞、Jen等研究一致[16-19]，由此推測Th17細胞及其特異性細胞因子IL-17參與了HSP的發(fā)病，但具體作用機制尚不十分明確，Th17細胞比例及IL-17水平的升高可能是HSP免疫紊亂的主要因素之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，HSP恢復(fù)期患兒Th17細胞比例、IL-17水平較急性期有所下降，但仍未恢復(fù)至正常兒童水平。提示恢復(fù)期患兒雖臨床癥狀已明顯緩解，但仍需繼續(xù)臨床治療，同時注意休息及飲食，以免癥狀反復(fù)。

Treg細胞的兩大功能為免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)，是機體維持自身免疫耐受的重要組成部分[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP急性期患兒Treg細胞比例與正常兒童相比明顯降低，與Chen[22]和Yang[23]等研究結(jié)果一致，然而Li等[24]發(fā)現(xiàn)，HSP急性期患兒Treg細胞與正常對照組相比無明顯降低。由此推測，Treg細胞同樣也參與了HSP的發(fā)病，而且Treg細胞數(shù)量減少導(dǎo)致的免疫抑制效應(yīng)不足可能是HSP免疫紊亂的重要原因之一，恢復(fù)期患兒Treg細胞比例回升，可能是Treg細胞對機體的免疫補償反應(yīng)。雖然不同研究數(shù)據(jù)間存在差異，但所有數(shù)據(jù)均提示HSP患兒急性期存在Th17、Treg細胞紊亂，只是Th17細胞可能在Th17/Treg細胞所致的免疫紊亂中起主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，HSP急性期患兒Th17/Treg細胞比值較正常兒童升高，恢復(fù)期患兒Th17/Treg細胞比值較急性期明顯降低，但未降至正常兒童水平，與Chen等[22]研究者一致，說明HSP患兒存在Th17/Treg細胞失衡。Th17/Treg細胞失衡可能是HSP免疫失衡的重要原因之一。另外，在疾病的不同時期Th17/Treg細胞比值不同，或許我們可以通過Th17/Treg細胞比值來推測HSP患兒所處疾病階段以及治療效果的評估，以指導(dǎo)臨床用藥。

IL-23/IL-17軸作為一種炎性通路并介導(dǎo)異常炎性反應(yīng)在多種炎性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[25-28]。IL-23通過誘導(dǎo)Th17細胞分化并促進IL-17產(chǎn)生和釋放，介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，HSP急性期患兒IL-23水平較正常兒童明顯升高， IL-23的水平與Th17細胞比例、IL-17水平呈正相關(guān)。由此提示，IL-23也參與HSP的發(fā)病，且作用機制與Th17細胞、IL-17密切相關(guān)，IL-23作為IL-23/IL-17軸的上游細胞因子且水平明顯升高，進一步說明IL-23/IL-17軸可能參與HSP的發(fā)病。

近來，腸黏膜屏障逐漸成為人們關(guān)注研究的熱點。大量研究表明腸黏膜屏障在多種疾病(如燒傷、休克、重癥胰腺炎等)的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[29-31]。Mazmanian等[32]發(fā)現(xiàn)，腸道共生菌影響腸黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP急性期患兒發(fā)生腸道菌群失調(diào)，而且腹型HSP患兒腸道菌群失調(diào)及腸黏膜通透程度相比其他類型更顯著。我們發(fā)現(xiàn)，單純型、腹型和其他類型HSP患兒Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17、IL-23的均值雖有依次遞增或遞減的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此推測，Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17、IL-23雖參與HSP的發(fā)病，但在不同類型HSP中所起作用無明顯差異，HSP患兒之所以有不同臟器受累以及多種臨床表現(xiàn)，各類型HSP可能存在其特殊的發(fā)病機制，比如，腹型HSP患兒可能還存在顯著腸道菌群紊亂以及腸黏膜屏障功能的破壞。因此，在HSP的治療過程中特別是腹型HSP的治療，除了調(diào)節(jié)免疫平衡外，還應(yīng)注重促進腸道菌群的調(diào)節(jié)和腸黏膜屏障功能的恢復(fù)。

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[收稿2016-03-16 修回2016-04-21]

(編輯 許四平)

Detection of Th17,Treg cells and IL-17,IL-23 levels in children with Henoch-Schonlein purpura

ZHANG Ting-Ting,JI Xiao-Fei,LI Shao-You,ZHAO Bo,DUAN Jiang,XIONG Jing-Jing,LIU Mei,HUANG Yong-Kun.

Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032，China

Objective:To study the changes of Th17，regulatory T(Treg) cells and IL-17，IL-23 levels at acute phase and recovery phase in children with Henoch-Schonlein purpura(HSP) in order to further understand the immunological pathogenesis and provide help for treating HSP.Methods:The vein blood samples were collected from 65 children with HSP and 30 normal children.The proportion of Th17 cells and regulatory T cells were tested by FCM and concentration of IL-17 and IL-23 in plasma were tested by ELISA.Results:Compared with normal children,the levels of Th17，Th17/Treg and IL-17，IL-23 were in increase at acute phase in children with HSP(P<0.05).At recovery phase,that were in decrease compared with the acute phase(P<0.05),but still higher than the normal children(P<0.05).Compared with normal children,the level of Treg was in decrease at acute phase in children with HSP(P<0.01).At recovery phase,that was in increase compared with the acute phase(P<0.01),but still lower than the normal children(P<0.01).Among the simplex,abdominal and other type of children with HSP,the levels of Th17，Treg，Th17/Treg and IL-17，IL-23 were same(P>0.05).At acute phase in children with HSP,Th17 cells percentage had positively correlated with IL-17 levels (r=0.880,P<0.01),IL-23 levels had positively correlated with Th17 cells percentage and IL-17 levels (r=0.838 or 0.877,P<0.01).Conclusion:Th17，Treg，Th17/Treg，IL-17 and IL-23 are involved in the course of the immunological pathogenesis in children with HSP,but the levels of that have no significant difference among simplex,abdominal and other types,further researches need to be done.

Henoch-Schonlein Purpura;Children;Th17 cell;Regulatory T cell;Interleukin-17;Interleukin-23

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.017

①本文為國家自然科學(xué)基金(No.81360068)和云南省自然科學(xué)基金面上項目(No.2013FB137)。

張婷婷(1986年-)，女，碩士，主要從事小兒消化系統(tǒng)疾病的診治和研究。

R725

A

1000-484X(2016)12-1801-05

及指導(dǎo)教師：黃永坤(1961年-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事小兒消化系統(tǒng)與營養(yǎng)、感染與免疫疾病的診治和研究，E-mail：13577097854@163.com。

②并列第一作者。

③昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，昆明650000。