2型糖尿病GK大鼠不同小腸段注射葡萄糖對(duì)血糖影響的實(shí)驗(yàn)研究*

艾小明 郭紹紅 楊念印 李勝春 徐 鯤

(南京明基醫(yī)院普外科 南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210019)

·實(shí)驗(yàn)研究·

2型糖尿病GK大鼠不同小腸段注射葡萄糖對(duì)血糖影響的實(shí)驗(yàn)研究*

艾小明 郭紹紅**楊念印 李勝春 徐 鯤①

(南京明基醫(yī)院普外科 南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210019)

目的 探討2型糖尿病GK大鼠不同小腸段注射葡萄糖對(duì)血糖的影響。 方法 將24只GK大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，每組8只。測(cè)各大鼠體重及尾部靜脈血空腹血糖。手術(shù)探查小腸全長(zhǎng)，將其分為三等分，用7號(hào)絲線結(jié)扎每段腸管的兩端，保留正常的腸系膜血液循環(huán)。A組向近側(cè)段小腸腔內(nèi)注射葡萄糖，B組向中間段小腸腔內(nèi)注射葡萄糖，C組向遠(yuǎn)側(cè)段小腸腔內(nèi)注射葡萄糖，注射量均為1 mg/kg，生理鹽水稀釋至1 ml。分別測(cè)定注射葡萄糖后2、15、45、75、120 min尾部靜脈血血糖。 結(jié)果 手術(shù)過程中5只大鼠死亡(A、B組各2只，C組1只)，手術(shù)存活率79.2%(19/24)。空腹血糖3組差異無顯著性[(12.97±3.12)、(12.11±3.80)及(12.61±3.25)mmol/L，F(xiàn)=0.099，P=0.906]。注射葡萄糖后，A、B、C組血糖均升高。2 min血糖A組[(15.57±3.14)mmol/L]和C組[(14.21±2.74)mmol/L]明顯高于B組[(11.67±0.23)mmol/L](P=0.008、0.011)，A、C組差異無顯著性(P=0.778)。15 min血糖A組[(21.23±3.16)mmol/L]>C組[(16.95±0.29)mmol/L]>B組[(14.06±3.00)mmol/L](P=0.006、0.049)。45 min血糖A組[(25.66±1.53)mmol/L]>C組[(17.63±1.46)mmol/L]>B組[(13.24±0.66)mmol/L](P=0.000、0.000)。75、120 min血糖3組差異無顯著性(P>0.05)。 結(jié)論采用分段結(jié)扎腸管注射葡萄糖的方法觀察到2型糖尿病GK大鼠各段小腸均表現(xiàn)出對(duì)血糖控制能力差，不同小腸部位控制血糖升高的能力具有差異，短時(shí)間內(nèi)中段小腸對(duì)血糖控制效果最好，遠(yuǎn)段小腸次之，近段小腸控制效果最差。

GK大鼠； 血糖； 小腸； 2型糖尿?。?手術(shù)

目前，胃轉(zhuǎn)流術(shù)(gastric bypass，GBP)治療肥胖合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)已成為一種被廣泛認(rèn)可的外科治療方法，其對(duì)T2DM的緩解率可達(dá)82.6%～88.6%[1]。Roux-en-Y胃轉(zhuǎn)流術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)是目前運(yùn)用極為廣泛的代謝手術(shù)術(shù)式[2]。手術(shù)治療T2DM取得了可喜的成果，但至今未能完全明確具體機(jī)制。近段小腸(十二指腸與近段空腸)和遠(yuǎn)段小腸(特別是末段回腸)的作用已成為研究的熱點(diǎn)，由此產(chǎn)生了前腸和后腸兩種假說，并認(rèn)為小腸在T2DM的發(fā)病過程中扮演重要角色[3]。既然研究一致認(rèn)為胃轉(zhuǎn)流術(shù)治療T2DM與手術(shù)改變了胃腸生理通道進(jìn)而影響到食物生理流向有關(guān)，那么理論上整個(gè)小腸的任何部位的腸段都有可能是參與血糖調(diào)控的關(guān)鍵部位。2型糖尿病大鼠(Goto-Kakizaki rats)(GK大鼠)是一種自發(fā)性2型糖尿病大鼠，是目前公認(rèn)的T2DM模型之一[4]，也是建立胃轉(zhuǎn)流術(shù)模型的最佳動(dòng)物。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究了正常SD大鼠不同小腸段在注入葡萄糖后血糖的動(dòng)態(tài)變化(待發(fā)表)。本研究在總結(jié)前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用GK大鼠作為研究對(duì)象，旨在進(jìn)一步探討糖尿病大鼠不同小腸段在注入葡萄糖后血糖的動(dòng)態(tài)變化，并推測(cè)其調(diào)節(jié)血糖的機(jī)理，為臨床手術(shù)治療T2DM提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要材料

11～12周齡的GK大鼠24只[常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2011-0003]，雄性，體重244～340 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料為糖尿病大鼠專用飼料(常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)。室溫22～24 ℃，12 h交替光照，相對(duì)濕度45%～60%，動(dòng)物自由攝取純凈水。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周。OneTouch SelectSimple血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)。AEL-200型電子分析天平(日本LIBROR公司)。丙泊酚(意大利阿斯利康制藥有限公司)，50%葡萄糖、生理鹽水(中國(guó)大冢制藥有限公司)。手術(shù)器械由南京明基醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 將24只GK大鼠按1、2、3…24數(shù)字序列標(biāo)記，隨機(jī)分為A、B、C三組，每組8只。

1.2.2 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前禁食12 h，不限飲水。測(cè)各組大鼠體重，取尾部靜脈血測(cè)空腹血糖。

1.2.3 分段結(jié)扎腸管 用10%水合氯醛(0.008 ml/g)和1%丙泊酚(0.03 mg/g)腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，大鼠取仰臥位，0.5%碘伏消毒，做上腹部正中切口，長(zhǎng)約4 cm。進(jìn)腹探查全小腸長(zhǎng)度，并將其均分為三等分，每段小腸的上下端都用7號(hào)絲線靠近腸壁結(jié)扎，阻止腸腔內(nèi)液體流動(dòng)到別的腸腔內(nèi)，但不影響小腸系膜的血液循環(huán)。

1.2.4 腸腔注射葡萄糖和測(cè)定血糖 用人體皮試針頭穿刺，向小腸腔內(nèi)注射葡萄糖液體，注射量1 mg/kg(用50%葡萄糖配置，生理鹽水稀釋至1 ml)。A組向近側(cè)段小腸腔內(nèi)注射，B組向中間段小腸腔內(nèi)注射，C組向遠(yuǎn)側(cè)段小腸腔內(nèi)注射。分別測(cè)定注射葡萄糖后2、15、45、75、120 min尾部靜脈血血糖。最后將全部大鼠按脊椎脫臼法處死。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)成功率及大鼠存活情況

手術(shù)過程中5只大鼠死亡：A組1只術(shù)中45 min死于失血量過多，1只術(shù)中75 min死于空氣栓塞；B組1只術(shù)前死于麻醉藥物中毒(麻醉藥物注入血管)，1只術(shù)中45 min死于空氣栓塞；C組1只術(shù)前死于麻醉藥物中毒(麻醉藥物注入血管)。手術(shù)存活率為79.2%(19/24)。死亡大鼠自統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中排除。

2.2 3組大鼠血糖變化

3組GK大鼠手術(shù)前后血糖水平變化見表1、圖1?？崭寡?組差異無顯著性。注射葡萄糖后，A、B、C組血糖均升高。2 min血糖A組和C組明顯高于B組，A、C組差異無顯著性；15 min和45 min血糖A組>C組>B組；75、120 min血糖3組差異無顯著性。

組別空腹注射葡萄糖后2min15min45min75min120minA(n=6)12．97±3．1215．57±3．1421．23±3．1625．66±1．5326．20±2．9126．73±2．61B(n=6)12．11±3．8011．67±0．2314．06±3．0013．24±0．6626．11±2．0327．64±0．36C(n=7)12．61±3．2514．21±2．7416．95±0．2917．63±1．4626．25±2．2726．93±1．64F值0．0995．82713．126142．8670．0270．351P值0．9060．0130．0000．0000．9730．710PA-B值0．0080．0000．000PA-C值0．7780．0060．000PB-C值0．0110．0490．000

圖1 GK大鼠注射葡萄糖前后血糖水平變化(時(shí)間“0”為空腹)

3 討論

T2DM是由于胰島素相對(duì)不足或周圍組織對(duì)胰島素敏感性下降引起的血糖升高，同時(shí)也存在體內(nèi)胰島素分泌水平或峰值下降，在進(jìn)食后不能引起胰島素分泌高峰的出現(xiàn)，導(dǎo)致血糖水平升高。目前T2DM的治療仍以內(nèi)科綜合治療為主，如口服降糖藥物、注射胰島素、運(yùn)動(dòng)與飲食控制等，但許多患者無法達(dá)到滿意療效。隨著減重手術(shù)在國(guó)內(nèi)外的廣泛開展，越來越多的臨床實(shí)踐證實(shí)，伴有T2DM的病態(tài)肥胖患者，在接受減重手術(shù)治療后，糖尿病的病情得到緩解，這一結(jié)果為T2DM的治療提供了新的思路。隨著外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步，減重手術(shù)，尤其是RYGB和膽胰轉(zhuǎn)流術(shù)(biliopancreatic diversion，BPD)作為治療肥胖合并糖尿病的方法已得到國(guó)際承認(rèn)[5]，因而又將其稱為“代謝手術(shù)”或“糖尿病手術(shù)”[6]，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟確定“代謝手術(shù)”作為治療肥胖合并2型糖尿病的方法[7]。美國(guó)2009年糖尿病防治指南中已將胃轉(zhuǎn)流術(shù)列入治療肥胖合并2型糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)[8]。2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)和外科學(xué)分會(huì)發(fā)表了“手術(shù)治療糖尿病專家共識(shí)”[9]，認(rèn)可代謝手術(shù)是治療伴有肥胖的T2DM的手段之一，并鼓勵(lì)內(nèi)外科合作共同管理接受代謝手術(shù)的T2DM患者。

研究證明胃轉(zhuǎn)流術(shù)可以使肥胖合并糖尿病獲得完全緩解，所以有學(xué)者認(rèn)為T2DM可能是一種小腸外科疾病[4,10]。現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為糖尿病是手術(shù)能夠治愈的胃腸道疾病即“胃腸型糖尿病”，這一理論認(rèn)為是胃腸道內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂導(dǎo)致了T2DM發(fā)病。代謝手術(shù)分為容量限制型、吸收不良型和混合型，RYGB屬于混合型。

手術(shù)治療T2DM的機(jī)制是研究的熱點(diǎn)。手術(shù)治療糖尿病最主要是降低糖尿病患者的胰島素抵抗，同時(shí)也可增加胰島素早期分泌的能力[11]。目前，我們?nèi)圆荒芡耆忉尣煌g(shù)式治療糖尿病的機(jī)制。但仔細(xì)審查現(xiàn)有的大量臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可大致得出結(jié)論，不同減重手術(shù)對(duì)糖尿病的治療效果與其對(duì)消化道的機(jī)械性改變有關(guān)[12]，可能與手術(shù)對(duì)胃腸道激素分泌的影響以及由此產(chǎn)生的胰島素分泌或敏感性改變有關(guān)[13]。術(shù)后降低血糖的機(jī)制研究轉(zhuǎn)向胃腸道激素的作用[14]。胃轉(zhuǎn)流術(shù)后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化部位從十二指腸、近段空腸轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)段空腸和回腸，使腸道激素發(fā)生顯著改變。胃轉(zhuǎn)流術(shù)治療T2DM的機(jī)制有多種假說和學(xué)說，大多是建立在消化道改道和重建的基礎(chǔ)上提出來的，而在胃腸道的黏膜上分布有大量?jī)?nèi)分泌細(xì)胞并分泌各種胃腸道激素，術(shù)后胃腸激素的變化被認(rèn)為是最主要機(jī)制[15]。這種胃腸激素與胰島素分泌之間的關(guān)系稱腸-胰島軸(enteroinsular axis)。腸-胰島軸假說分為前腸假說(foregut hypothesis)及后腸假說(hindgut hypothesis)。該假說認(rèn)為近段小腸受食物刺激后可能分泌抑制胰島素的激素(即前腸假說)，主要包括抑胃肽(gastric inhibitory peptide，GIP)；而遠(yuǎn)段小腸尤其是末段回腸受食物刺激后可分泌促進(jìn)胰島素分泌的激素(即后腸假說)，主要包括胰高血糖素樣肽1(glucagon like peptide 1，GLP-1)和神經(jīng)肽YY(peptide YY，PYY)，目前認(rèn)為GLP-1是腸-胰島軸控制T2DM最核心的介導(dǎo)因子[16]。此外，還有神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說、脂肪-胰島軸假說、炎性介質(zhì)假說及其他一些激素變化等機(jī)制?？偠灾改c道功能及內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)二者間并不是各自獨(dú)立的，而是形成復(fù)雜的雙相反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)[17]。

我們前期實(shí)驗(yàn)研究顯示，從血糖控制方面來看，正常SD大鼠近段小腸控制效果最差，中間段小腸次之，遠(yuǎn)段小腸效果最好。這些都可能與胃腸道激素分泌的影響有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于GK糖尿病大鼠，注射葡萄糖后，A(近段)、B(中間段)、C組(遠(yuǎn)段)血糖均呈升高趨勢(shì)，對(duì)血糖控制能力都很差。但在短時(shí)間內(nèi)(術(shù)后2、15、45 min)，中間段小腸血糖控制效果最好，遠(yuǎn)段小腸次之，近段小腸控制效果最差。中間段和遠(yuǎn)段的差異與正常大鼠的研究結(jié)果有所不同。這說明GK大鼠近段小腸控制血糖能力最差，可能是近段小腸存在抵抗胰島素活性的激素，主要是GIP。遠(yuǎn)段小腸則可能存在改善胰島素敏感性的激素，推測(cè)主要是GLP-1和PYY。而中間段小腸短時(shí)間內(nèi)控制血糖效果最好，推測(cè)也可能與GLP-1和PYY有關(guān)。提示我們胃轉(zhuǎn)流手術(shù)要重視中段小腸的作用。郭曉博等[18]對(duì)GK大鼠不同區(qū)段小腸轉(zhuǎn)流的手術(shù)模型研究也顯示，轉(zhuǎn)流的最佳效應(yīng)區(qū)域是小腸中段，即空腸與回腸交界處為宜，這就需在術(shù)中權(quán)衡距Treitz韌帶切斷空腸及引流襻長(zhǎng)短的距離，使得轉(zhuǎn)流部位確定為小腸中段而發(fā)揮手術(shù)最大效應(yīng)。張曉梅等[19]認(rèn)為，小腸轉(zhuǎn)流的最佳效應(yīng)區(qū)域位于小腸中段，即空腸與回腸交界處為宜，既保留了手術(shù)的降糖作用，又最大限度地減少了營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生率。

本研究的特點(diǎn)是采用分段結(jié)扎腸道注射葡萄糖的方法觀察GK糖尿病大鼠不同小腸部位控制血糖升高的能力及差異性。本實(shí)驗(yàn)的缺陷是：①選擇GK糖尿病大鼠，并不一定能代表人類的實(shí)際情況；②是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；③沒有對(duì)大鼠血液中胃腸道激素的變化及胰島素的變化進(jìn)行測(cè)定。所以目前還不能直接將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷為人體的實(shí)際情況。今后需要重點(diǎn)研究糖尿病GK大鼠不同小腸段黏膜和糖尿病相關(guān)內(nèi)分泌激素，以期為外科手術(shù)治療T2DM提供更多的基礎(chǔ)理論支持。

1 Buchwald H,Estok R,Fahrbach K,et al.Weight and type 2 diabetes after bariatric surgery：systematic review and meta-analysis.Am J Med,2009,122(3):248-256．

2 Buchwald H，Oien DM．Metabolic/bariatric surgery worldwide 2011．Obes Surg，2013，23(4)：427-436．

3 Rubino F．Is type 2 diabetes an operable intestinal disease?A provocative yet reasonable hypothesis．Diabetes Care，2008，31(Suppl 2)：S290-S296．

4 Partha B. Programmed disorders of beta-cell development and function as one cause for type 2 diabetes? The GK rat paradigm.Diabetes Metab Res Rev, 2005, 21：495-504．

5 Mingrone G，Panunzi S，De Gaetano A，et al．Bariatric surgery versus conventional medical therapy for type 2 diabetes．N Engl J Med，2012，366(17)：1577-1585．

6 鄒大進(jìn)，鄭成竹，吳 鴻，等．代謝手術(shù)治療糖尿病專家共識(shí)．中華糖尿病雜志，2011，6(3)：205-208．

7 Dixon JB，Zimmet P，Alberti KG，et al．Bariatric surgery：an IDF statement for obese type 2 diabetes．Diabet Med，2011，28(6)：628-642．

8 林允信，許昌泰．胃旁路手術(shù)治療2型糖尿病研究現(xiàn)狀．醫(yī)學(xué)綜述，2011，17(6)：902-905．

9 中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)．手術(shù)治療糖尿病專家共識(shí)．中國(guó)實(shí)用外科雜志，2011，31(5)：367-370．

10 Laferrère B，Swerdlow N，Bawa B，et al．Rise of oxyntomodulin in response to oral glucose after gastric bypass surgery in patients with type 2 diabetes．J Clin Endocrinol Metab，2010，95(8)：4072-4076．

11 Dirksen C，Jorgensen NB，Bojsen-Moller KN，et al．Mechanisms of improved glycaemic control after Roux-en-Y gastric bypass．Diabetologia，2012，55(7)：1890-1901．

12 Stefater MA，Wilson-Perez HE，Chambers AP，et al．All bariatric surgeries are not created equal：insights from mechanistic comparisons．Endocr Rev，2012，33(4)：595-622．

13 Flatt PR．Effective surgical treatment of obesity may be mediated by ablation of the lipogenic gut hormone gastric inhibitory polypeptide (GIP)：evidence and clinical opportunity for development of new obesity-diabetes drugs．Diab Vasc Dis Res，2007，4(2)：151-153．

14 Lee WJ，Lee YC，Ser KH，et al．Improvement of insulin resistance after obesity surgery：a comparison of gastric banding and bypass procedures．Obes Surg，2008，18(9)：1119-1125．

15 Lawson ML，Kirk S，Mitchell T，et al．One-year outcomes of Roux-en-Y gastric bypass for morbidly obese adolescents：a multicenter study from the Pediatric Bariatric Study Group．J Pediatr Surg，2006，41(1)：137-143．

16 Stearns AT，Balakrishnan A，Rhoads DB，et al．Rapid upregulation of sodium-glucose transporter SGLT1 in response to intestinal sweet taste stimulation．Ann Surg，2010，251(5)：865-871．

17 Nauck MA，Kemmeries G，Holst JJ，et al．Rapid tachyphylaxis of the glucagon-like peptide 1-induced deceleration of gastric emptying in humans．Diabetes,2011,60(5)：1561-1565．

18 郭曉博，高宏凱，高艷紅，等．保留全胃、不同區(qū)段小腸轉(zhuǎn)流術(shù)后GK大鼠糖代謝變化規(guī)律的研究．中國(guó)糖尿病雜志，2010，18(2)：92-94．

19 張曉梅，高宏凱，吳致委，等．胃轉(zhuǎn)流術(shù)后血糖與胰升血糖素樣肽-1改變的實(shí)驗(yàn)研究．中國(guó)糖尿病雜志，2013，21(2)：181-184．

(修回日期：2015-12-03)

(責(zé)任編輯：王惠群)

Effects of Glucose Injection at Different Segments of Small Intestine on Blood Glucose Level in Type 2 Diabetes Mellitus Goto-Kakizaki Rats

AiXiaoming,GuoShaohong,YangNianyin,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,BenQMedicalCenterofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210019,China

Correspondingauthor:GuoShaohong,E-mail:gsh1960@163.com

Objective To evaluate the effect of glucose injection at different segments of small intestine on blood glucose level in Goto-Kakizaki (GK) rats with type 2 diabetes mellitus. Methods Twenty-four GK rats were randomly divided into three groups (Group A, B, and C) with each group of 8 rats. The body weight and values of fasting plasma glucose (FPG) were measured. All the rats underwent an operation. The whole length of small intestine was separated into three segments averagely: proximal, middle, and distal segment，with ligation of silk thread. In the Group A, 50% glucose was injected into the enteric cavity of proximal segment. In the Group B, 50% glucose was injected into the enteric cavity of middle segment. And in the Group C, distal segment. The values of blood glucose were tested at 2 min, 15 min, 45 min, 75 min and 120 min after injection of glucose. Results Five rats died during the operation, including 2 in the Group A, 2 in the Group B, and 1 in C. The survival rate of the operation was 79.2% (19/24). There were no significant differences on the values of FPG among the three groups [(12.97±3.12), (12.11±3.80) and (12.61±3.25) mmol/L,F=0.099,P=0.906]. In general, the values of blood glucose in all the groups were increased substantially after injection of glucose. At 2 min after injection, the values of blood glucose in the Group A [(15.57±3.14) mmol/L] and C [(14.21±2.74) mmol/L] were significantly higher than that in the Group B [(11.67±0.23) mmol/L,P=0.008 and 0.011], meanwhile no significant difference was found between the Group A and C (P=0.778). At 15 min after injection, there could be found significant differences among the three groups [A (21.23±3.16) mmol/L > C (16.95±0.29) mmol/L > B (14.06±3.00) mmol/L,P=0.006 and 0.049]. Furthermore, at 45 min after injection, there also could be found significant differences among the three groups [A (25.66±1.53) mmol/L > C (17.63±1.46) mmol/L > B (13.24±0.66) mmol/L,P=0.000 and 0.000]. However, at 75 and 120 min after injection, there were no significant differences among the three groups (P>0.05). Conclusions All segments of small intestine in GK rats showed bad effects on blood glucose control after injection of glucose. However, during short time intervals (2, 15, 45 min after injection), effect of middle segment of small intestine on blood glucose control was the best, effect of distal segment was moderate, and proximal segment the worst. Different segments of small intestine show different effects on blood glucose control in GK rats.

Goto-Kakizaki rats; Blood glucose; Small intestine; Type 2 diabetes mellitus; Operation

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目(YKK10172)

A

1009-6604(2016)01-0068-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.01.019

2015-04-22)

**通訊作者，E-mail：gsh1960@163.com

①(江蘇省中醫(yī)院普外科，南京 210019)