高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

孫韜黃竹娟蘇寧

【摘要】目的：研究在高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷干預(yù)對人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法：本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，分別檢測在高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷干預(yù)24h、48h、72h 上皮細(xì)胞增殖及凋亡情況，并同時設(shè)立陰性對照組（低糖組）、陽性對照組（高糖組）和陽性藥物對照組（RGZ）。結(jié)果：24h、48h時間點(diǎn)，黃芩苷干預(yù)下的上皮細(xì)胞以促進(jìn)增殖、抑制凋亡為主要表現(xiàn)；72h時間點(diǎn)，低劑量黃芩苷（50、100μmol/L）干預(yù)下的上皮細(xì)胞仍以促進(jìn)增殖、抑制凋亡為主要表現(xiàn)，但高劑量黃芩苷組別（200μmol/L）干預(yù)下的上皮細(xì)胞以抑制增殖、促進(jìn)凋亡為主要表現(xiàn)。在高糖環(huán)境下黃芩苷可抑制上皮細(xì)胞凋亡，與陽性藥物對照（RGZ）的趨勢一致。結(jié)論：黃芩苷可能通過抑制細(xì)胞凋亡的藥理作用，發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】黃芩苷；人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）；細(xì)胞凋亡；糖尿病

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）21-0029-03

Effect of Baicalin Bai on HK-2 cells Apoptosis in High GLucose Medium

SUN Tao1，2HUANG Zhujuan1SU Ning1*

1.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China；2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Co.， Ltd ， Guangzhou 510730， China

Abstract：Objective To study the effect of Baicalin Bai（BB） on HK-2 cells apoptosis in high glucose medium.Methods The cell proliferation was detemined with MTT method at 24h，48h，72h respectively after HK-2 cells were incubated with normal glucose， high glucose， high glucose plus RGZ or high glucose plus BB.Results At 24h & 48h，in comparison with NG & HG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly. At 72h，in comparison with NG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly except for the high – dose HG+BB group（200μmol/L）.During the observation，the effect of BB on HK-2 cells growth cultured in high glucose medium is facilitative mainly， it′s similar to RGZ in concentration and times.Conclusion BB pharmacological effects by inhibiting apoptosis， play a protective effect on the kidneys.

Keywords：HK-2；Kidney Tubules；Cell Division；High Glucose

糖尿病腎病[1] （diabetic nephropathy，DN）是以腎臟微血管病變作為最主要表現(xiàn)的糖尿病并發(fā)癥，也是造成慢性腎衰的主要病因，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來，隨著研究的深入，證實(shí)細(xì)胞凋亡參與DN發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞死亡的重要途徑[2]，細(xì)胞的死亡和更新是多細(xì)胞生物整個生命過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，可及時清除機(jī)體內(nèi)的多余細(xì)胞和受損傷細(xì)胞，對各組織器官的發(fā)育及免疫系統(tǒng)的建立發(fā)揮重要作用。通常情況下，細(xì)胞凋亡過程受機(jī)體內(nèi)嚴(yán)格調(diào)控，以維持整個生命過程中各組織器官的穩(wěn)定性。但當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時，可引起細(xì)胞過度增殖或過度凋亡，都是導(dǎo)致糖尿病腎病患者腎功能進(jìn)一步惡化的重要因素之一。

傳統(tǒng)藥物黃芩（scutellaria baicalensis georgi）為唇形科植物黃芩的干燥根，迄今己有2000多年的藥用歷史，該藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，用于“諸熱黃膽，腸泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”。黃芩苷（baicalin bai，BB）是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化、治療或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥等藥理作用[3]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷對糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護(hù)作用[4-8]。在此基礎(chǔ)上，本文通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察在高糖環(huán)境下不同濃度的黃芩苷對人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）細(xì)胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料HK-2細(xì)胞株購自于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，鹽酸羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品、黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，批號20141201），DMEM 低糖和高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（上海立菲生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司），噻唑藍(lán)（MTT，美國sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，美國sigma公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組HK-2細(xì)胞株置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中用含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按以4000/孔的密度接種于96孔板，每孔加入100μL 含10%FBS的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0期。棄去培養(yǎng)液，將HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為7組（每組設(shè)5個復(fù)孔）：A組（NG）：DMEM 低糖培養(yǎng)液（D-葡萄糖濃度為5.5mmol/L）；B組（HG）：DMEM 高糖培養(yǎng)液（D-葡萄糖濃度為25mmol/L）；C組（HG+R5）：DMEM 高糖培養(yǎng)液和RGZ（終濃度為5μmol/L）；D組（HG+R10）：DMEM 高糖培養(yǎng)液和RGZ（終濃度為10μmol/L）；E組（HG+BB50）：DMEM 高糖培養(yǎng)液和BB（終濃度為50μmol/L）；F組（HG+BB100）：DMEM 高糖培養(yǎng)液和BB（終濃度為100μmol/L）；G組（HG+BB200）：DMEM 高糖培養(yǎng)液和BB（終濃度為200μmol/L）。分別干預(yù)24、48、72h，共設(shè)3個實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)。

1.3 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖當(dāng)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束（24、48、72h）時，使用濃度為5mg/mL的MTT溶液加入待測孔，孵育4h，棄去廢液，重新加入DMSO 150μL /孔，振蕩10min后，放入iMark 吸收光酶標(biāo)儀（選擇490nm波長，Bio-Rad 公司）進(jìn)行檢測并記錄結(jié)果（OD值）。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率采用AnnexinV-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙標(biāo)記染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。按上述分組方法，以4000/孔的密度將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)結(jié)束（24、48、72 h）時，用流式細(xì)胞儀檢測各組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率（Q2+Q4）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并orgin pro 8.0繪圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用Bartlett球形檢驗(yàn)方差齊性，方差齊性時多組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），Post-hoc 檢測采用 Tukey方法；方差不齊時采用Kruskal-Wallis H進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對HK-2細(xì)胞增殖的影響在24h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。F組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余組別與B組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在48h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組、C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在72h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、D組、E組和F組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其余組別與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。C組、D組和F組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余組別與B組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果詳見表1和圖1。

2.2高糖環(huán)境下不同濃度黃芩苷對HK-2細(xì)胞凋亡率的影響在24h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在48h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中， C組、D組、E組、F組和G組與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在72h的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)中，B組、C組、E組和與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；D組、F組與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。C組、D組、E組、F組和G組與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果詳見表2。

3討論

MTT比色法是目前檢測細(xì)胞增殖的常用手段之一，其主要原理[9]是利用四甲基偶氮唑鹽在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，由淡黃色被還原成藍(lán)紫色或藍(lán)黑色的MTT-甲肷，形成的量與活細(xì)胞代謝率及細(xì)胞增殖程度成正相關(guān)。在研究中觀察到，在高糖環(huán)境下，HK-2細(xì)胞增殖快速（B組與A組比較），低、中濃度黃芩苷影響下的HK-2細(xì)胞增殖快速，高濃度黃芩苷影響下的HK-2細(xì)胞增殖受抑制，72h觀察時間點(diǎn)最為顯著。提示高糖對HK-2細(xì)胞產(chǎn)生雙重效應(yīng)，既能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，在高濃度藥物環(huán)境下，又可抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)使用的陽性對照組（RGZ）的HK-2細(xì)胞增殖情況與既往研究的報(bào)道[10]基本一致。

流式Annexin V/PI 雙染法是目前比較常用、靈敏較高的細(xì)胞凋亡測定方法，其主要原理是通過Annexin V-FITC和PI雙重?zé)晒鈽?biāo)記以區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。在研究中觀察到，在高糖環(huán)境下，HK-2細(xì)胞凋亡顯著增多（B組與A組比較），結(jié)合MTT檢測結(jié)果提示在高糖環(huán)境下HK-2呈高增殖伴高凋亡率。在藥物（包括BB、RGZ）影響下，可顯著降低凋亡率。但是高濃度黃芩苷（G組）在72h觀察時間點(diǎn)的凋亡率較其他用藥組別顯著升高，結(jié)合MTT檢測中低增殖的表現(xiàn)，考慮高濃度黃芩苷促進(jìn)HK-2細(xì)胞凋亡，抑制HK-2細(xì)胞增殖，而低、中濃度黃芩苷抑制HK-2細(xì)胞凋亡、促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果[4-8]提示黃芩苷可能通過抑制細(xì)胞凋亡的藥理作用，發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用。

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（編輯：穆麗華）