循環(huán)腫瘤DNA檢測在乳腺癌診斷中的臨床應用

葉　青 綜述　江澤飛 審校

軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院乳腺腫瘤科，北京 100071

循環(huán)腫瘤DNA檢測在乳腺癌診斷中的臨床應用

葉青 綜述江澤飛 審校

軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院乳腺腫瘤科，北京 100071

隨著二代測序技術的發(fā)展，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)檢測在乳腺癌中的應用得到越來越多的關注。目前國內外大量研究顯示ctDNA檢測技術在監(jiān)測腫瘤負荷、療效預測、早期診斷、預后分析等方面具有廣闊的應用價值。在乳腺癌診療走向個體化精準的時代，ctDNA檢測能夠為患者提供更為精準的診斷，指導臨床治療。

循環(huán)腫瘤DNA；乳腺癌；診斷；臨床應用

早在1948年，Mandel和Metais就在人的血漿中檢測出細胞外游離DNA的存在，由此拉開了游離DNA研究的序幕；1965年，Bendich的團隊發(fā)現(xiàn)腫瘤與循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)存在相關性；1977年，Leon等人通過放射免疫測定法對比了正常人和腫瘤患者血中游離DNA的表達，表明血中游離DNA水平與腫瘤病程及療效相關；隨后更多證據表明血中游離DNA與原發(fā)腫瘤基因突變存在一致性［1］；2010年，García-Olmo等［2］的研究確定了游離DNA的致癌性。近幾年循環(huán)DNA的研究已成為癌癥診斷的熱門研究領域，在腫瘤負荷監(jiān)測、藥物療效預測、復發(fā)轉移監(jiān)測、早期診斷及預后分析等方面具有潛在的臨床應用價值。

1　　循環(huán)腫瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)

1.1cfDNA與ctDNA

cfDNA是由正常細胞、腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤細胞等凋亡、壞死后釋放到血管中的游離的DNA片段組成的。這些DNA片段通常與蛋白質結合形成核小體游離于循環(huán)中［3］。其中ctDNA特指能夠反映腫瘤基因組信息的cfDNA［4］。

關于ctDNA的釋放、降解機制目前尚無定論。目前認為，ctDNA來源于壞死、凋亡的腫瘤細胞，或是腫瘤細胞的外排體［5］。而ctDNA的降解可能與肝臟和腎臟代謝相關，根據不同DNA片段大小、結構其半衰期差異較大，范圍從10 min至2 h不等。

1.2ctDNA的檢測優(yōu)勢及困難

組織學活檢能夠提供疾病的初始狀態(tài)，為疾病的診斷、治療提供重要的信息。盡管組織學檢測目前是臨床和科研測序的金標準，但是組織獲取、樣本保存、腫瘤異質性等局限性限制了腫瘤組織測序的發(fā)展。因此，為了彌補組織活檢的局限性，研究者開展“液體活檢”工作。因能反映與組織相同的基因組信息，ctDNA成為補充替代組織學測序的最佳來源。相對無創(chuàng)的ctDNA檢測不僅能夠反映短時間體內瘤負，實時動態(tài)監(jiān)測藥物療效，而且在保證較高敏感性和特異性的同時能夠提早預測病情變化。

在原理上，ctDNA測序簡單易懂，但該技術用于臨床仍面臨著許多技術難點和現(xiàn)實問題。首先是對于大部分腫瘤患者而言，在全部的血漿游離DNA中，ctDNA只占很小的一部分，大約只有千分之幾［6］，因此，目標突變信號相對與背景信號其強度極低。其次，因每毫升血漿中僅有幾十至幾百納克(ng)的游離DNA，分離樣本量極少的cfDNA難度大。傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取效率低，而商業(yè)試劑盒簡便易行，且可以針對不同目標檢測設計專門的試劑盒。Kuang等［7］對比了以下3種商業(yè)試劑盒分離cfDNA的效能：QIAamp DNA Micro 試劑盒(德國Qiagen公司)、NucleoSpin Plasma XS(德國Macherey-Nagel公司)和Wizaed(美國Promega公司)，結果顯示QIAamp DNA Micro試劑盒更適用于ctDNA的檢測。此外，由于ctDNA檢測技術對實驗室和操作人員要求較高，檢測設備昂貴，檢測標準不一，也難以在短時間內推廣至臨床應用。

1.3ctDNA檢測方法

理論上，所有檢測基因組信息的手段都可以檢測ctDNA，但是由于以sanger測序為代表的一代測序方法檢測敏感性不高，長久以來一直限制著ctDNA檢測的發(fā)展。隨著二代測序技術的出現(xiàn)，使cfDNA的檢測成為可能。目前，常用的方法包括實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)、BEAMing(beads，emulsion，amplification, and magnetics)技術［6］、基因芯片技術和二代測序技術等，這些檢測各有其優(yōu)缺點(表1)。

表1　常用循環(huán)腫瘤DNA檢測技術比較Tab. 1 Commonly used technologies to analyze cell-free DNA

2　　ctDNA檢測在乳腺癌中的臨床應用

關于乳腺癌ctDNA的研究，可以追溯到1977年，Leon等人發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的血液中游離DNA水平顯著上升，通過放射免疫檢測法他們檢測到這些游離DNA范圍在0～2 000 ng/mL間波動［1］。此后，大量乳腺癌的ctDNA臨床應用的文獻被報道，這些應用主要集中在ctDNA與腫瘤負荷監(jiān)測、藥物療效預測、復發(fā)轉移風險評估、早期診斷及預后分析等方面。

2.1ctDNA與腫瘤負荷監(jiān)測

腫瘤負荷監(jiān)測是指對腫瘤危害機體程度的監(jiān)測，包括腫瘤大小、活躍程度、轉移情況等，是乳腺癌患者管理的重要內容之一。臨床實踐中，一般通過影像、蛋白質類生物標志物(CEA、CA15-3和CA-125)來監(jiān)測腫瘤負荷。而影像學檢查有時難以區(qū)分腫瘤輕微的變化，腫瘤標志物(如CA15-3)監(jiān)測雖便捷但前期研究表明其敏感性僅為60%～70%［8］。ctDNA因其特有的優(yōu)勢，有望成為監(jiān)測腫瘤負荷的特異性標志物。

對于晚期乳腺癌患者，有研究報道顯示，ctDNA能夠監(jiān)測實體瘤患者的腫瘤負荷，ctDNA的水平與臨床療效是顯著相關的。Dawson等［9］動態(tài)監(jiān)測了30例晚期乳腺癌患者的ctDNA、循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)和CA15-3水平。研究者將循環(huán)中攜帶與組織相同的乳腺癌相關體細胞突變(其檢測了PIK3CA和TP53兩個基因)認定為ctDNA。結果顯示，與CA15-3、CTC相比，在治療期間患者特異性ctDNA水平變化與療效相關性最強，具有更高的敏感性和特異性；并且ctDNA水平的增高平均能早于臨床影像檢查5個月提示疾病進展。提示了對于晚期乳腺癌患者，ctDNA是監(jiān)測腫瘤負荷敏感、特異的生物標志物，其水平變化提示腫瘤負荷變化從而反映藥物療效。在臨床療效評價不確定如疾病穩(wěn)定，或是病灶分離情況出現(xiàn)時，ctDNA檢測可能更有優(yōu)勢。

對于早期乳腺癌患者，ctDNA的檢測同樣能提示腫瘤的負荷。Tangvarasittichai等［10］研究了cfDNA水平與乳腺癌臨床分期間的關系，發(fā)現(xiàn)Ⅱ～Ⅳ期患者cfDNA濃度顯著高于術后患者和健康對照組，并且腫塊大小、TNM分期、遠處轉移與cfDNA濃度是顯著相關的。另外，Umetani等［11］同樣發(fā)現(xiàn)Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌患者血漿DNA完整性顯著高于健康女性，ROC曲線分析顯示以cfDNA完整性診斷Ⅱ期以上乳腺癌患者的AUC值為0.79，診斷淋巴結轉移乳腺癌的AUC值為0.81。另外，近期發(fā)布的一項研究入組了87例接受新輔助治療的乳腺癌患者，分別在新輔助治療前、治療后和術后1年監(jiān)測ctDNA的甲基化(met-ctDNA)。結果顯示，新輔助治療后的met-ctDNA與殘留腫瘤負荷顯著相關(P=0.008)［12］。

ctDNA濃度、完整性的檢測均能夠間接反映腫瘤負荷。對于晚期乳腺癌通過動態(tài)監(jiān)測這些指標能夠早于影像檢查判斷疾病進展，為患者及時調整治療方案創(chuàng)造機會；對于早期乳腺癌患者通過檢測這些指標能夠協(xié)助臨床診斷，提供更為全面的診斷信息，為治療方案的制定提供補充信息。

2.2ctDNA與藥物療效預測

乳腺癌治療已經進入分子分型指導下的個體化治療的時代，通過檢測一些指標能很好地預測患者對某些治療的反應，這些指標包括：激素受體狀況、HER-2基因擴增、Ki-67基因表達等。但這些預測指標現(xiàn)行的檢測重復性較差，無法動態(tài)監(jiān)測腫瘤治療過程中的變化，而ctDNA的檢測因能特異性地反應腫瘤基因組狀況并且無需通過組織活檢，在腫瘤療效預測方面(特別是預測耐藥)具有潛在應用前景。

Stoetzer等［13］發(fā)現(xiàn)，新輔助化療不敏感組患者治療前cfDNA顯著高于治療獲益的患者。提示，治療前cfDNA水平可能預測新輔助化療獲益程度。Gevensleben等［14］利用數字PCR方法檢測乳腺癌患者cfDNA中HER-2基因拷貝數目的情況。驗證組58例晚期乳腺癌患者，64%的HER-2陽性患者血漿HER-2檢測為陽性，94%的HER-2陰性患者的血漿HER-2檢測為陰性，其陽性、陰性預測值分別為70%和92%。證明了cfDNA檢測乳腺癌患者HER-2基因擴增情況的可行性。但Bechmann等［15］的結果卻完全不同，其前瞻性研究結果提示，采用RTFQ-PCR技術檢測cfDNA和HER-2基因擴增情況，結果發(fā)現(xiàn)組織學HER-2基因擴增并未觀察到患者血漿HER-2基因拷貝數目的差異。這些實驗結果差異可能是由于檢測技術敏感性、入組人群、操作規(guī)范、陽性預測閾值的不同而引起的。因此采用cfDNA檢測技術評估部分患者HER-2基因擴增情況，以此預測靶向治療的敏感性仍需要大型臨床研究證實。

另外一些小樣本研究結果顯示，cfDNA檢測能早于臨床預測獲得性耐藥的發(fā)生。對于內分泌治療，已有研究表明ESR1配體結合域的活化是乳腺癌內分泌耐藥的主要原因。Guttery等［16］檢測48例激素受體陽性晚期乳腺癌患者cfDNA的ESR1突變情況，初步探索了利用cfDNA技術預測乳腺癌內分泌治療耐藥的可行性。Murtaza等［17］利用全外顯子測序技術檢測ctDNA用于獲得性耐藥預測的可行性。結果發(fā)現(xiàn)6個與不同藥物耐藥相關的基因突變，該研究首次證明全外顯子測序技術檢測ctDNA提早預測治療耐藥發(fā)生的可行性。

2.3ctDNA與復發(fā)轉移風險評估

目前認為，晚期乳腺癌是不可治愈的，原因可能與臨床診斷滯后相關。因此尋找早期、特異的指標檢測微小轉移灶，預測復發(fā)轉移風險對于治愈腫瘤十分重要；既能通過治療提早干預臨床轉移灶的出現(xiàn)，又能避免部分術后治愈的患者接受過度的輔助治療。

Shaw等［18］通過分析輔助階段乳腺癌患者cfDNA水平，探究該方法用于篩選經輔助治療治愈的患者、避免其接受過度治療的可能性。Olsson等［19］通過全基因組測序篩選出20例乳腺癌患者原發(fā)灶可信的特異腫瘤相關染色體重排，之后采用高度敏感的微滴數字PCR方法，連續(xù)監(jiān)測這20例輔助治療階段患者循環(huán)血與原發(fā)灶中相同的特異性DNA的重排情況，發(fā)現(xiàn)其預測復發(fā)轉移敏感變?yōu)?9%，且平均早于臨床復發(fā)轉移11個月。首次證明了ctDNA用于乳腺癌復發(fā)風險監(jiān)測的可能性。隨后Garcia-Murillas等［20］檢測55例接受新輔助化療患者原發(fā)灶腫瘤DNA突變情況，其中43例患者存在至少1個體細胞突變，通過個體化設計的數字PCR技術監(jiān)測這43例乳腺癌患者新輔助化療前、術后2～4周內、輔助治療期間游離血漿中每個腫瘤特異性體細胞突變的情況。結果顯示，80%的復發(fā)轉移患者在輔助治療連續(xù)隨訪期間檢測到ctDNA，50%的復發(fā)患者在術后首次血液檢測中就能檢測到ctDNA，并能平均早于臨床影像檢查7.9個月預測復發(fā)轉移發(fā)生。一系列的研究結果表明ctDNA檢測技術監(jiān)測復發(fā)轉移可能較影像、癌標等傳統(tǒng)手段更為特異，敏感。

2.4ctDNA與早期診斷

早期診斷是降低乳腺癌死亡率的最重要方法之一。現(xiàn)行篩查手段主要依靠影像學方法，但影像學檢查的分辨率有限，有時難以區(qū)分良惡性，并且難以實現(xiàn)群體間的篩查。cfDNA檢測因取樣方便、檢測結果判讀客觀可能成為乳腺癌早診篩查的有力工具。

Gong等［21］分析了乳腺良、惡性疾病患者、健康者cfDNA濃度，ROC曲線分析結果提示cfDNA用于診斷3組人群的特異性均大于0.9，提示cfDNA濃度的檢測能夠用于早期診斷。近期發(fā)布的一項研究納入了749例早期乳腺癌、良性疾病和健康者，僅檢測6個基因的甲基化情況診斷乳腺癌的特異性和敏感性分別達到78.1%和82.4%，提示血漿中的表觀遺傳學的生物標志物具有潛在診斷價值［22］。

2.5ctDNA與預后分析

目前關于ctDNA的預后價值尚存在爭議，各實驗室間的結論并不一致，原因可能是多方面的，包括樣本處理、操作規(guī)范、DNA提取、檢測技術、入組人群等差異。

Madic等［23］納入40例三陰性乳腺癌患者，采用NGS平臺檢測26例腫瘤組織存在TP53體細胞突變，并且在21例匹配的血樣樣本中檢測相同TP53突變即ctDNA，結果并未發(fā)現(xiàn)這21例患者ctDNA的水平與疾病進展時間(time to progression，TTP)和總生存期(overall survival，OS)的相關性。而Madhavan等［24］的研究結果卻截然不同。他們通過定量PCR方法檢測了晚期乳腺癌患者cfDNA完整性及水平，結果顯示cfDNA完整性與水平都能預測晚期乳腺癌無進展生存期(progression-free survival，PFS)和OS。另外，Dawson等［9］的結果提示乳腺癌患者ctDNA水平與預后密切相關，含量越高5年生存率越低。Oca?a等［25］近期發(fā)布的一項入組了31項實驗包括4 052例實體瘤患者的Meta分析結果也提示高水平的cfDNA和ctDNA與實體瘤患者的不良預后是顯著相關的。

3　　結語

隨著精準醫(yī)療概念的提出，乳腺癌診療將從個體化走向精準；以基因檢測為代表的精準診斷模式，將會是未來乳腺癌精準診療的重要組成部分。ctDNA檢測技術的發(fā)展正是邁向精準診斷重要的一步。但目前該領域研究仍處于起步階段，ctDNA研究還處于科研階段，其臨床應用仍然任重道遠。

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Clinical utility of circulating tumor DNA detection for diagnosis of breast cancer

YE Qing, JIANG Zefei
(Department of Breast Cancer, Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)
Correspondence to: JIANG Zefei E-mail: jiangzf@hotmail.com

With the development of the next generation sequencing technology, considerable attention has been paid to the utility of circulating tumor DNA (ctDNA) detection in breast cancer. There are many clinical trials showed the ctDNA detection is a potential biomarker for the diagnosis, management and prognosis of breast cancer. ctDNA detection can provide a more accurate diagnosis for patients to guide clinical treatment in precision medicine era.

Circulating tumor DNA; Breast cancer; Diagnosis; Clinical utility

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.012

R730.43

A

1007-3639(2016)11-0947-05

國家自然科學基金資助項目(81472477)。

江澤飛E-mail:jiangzf@hotmail.com

（2015-12-10

2016-03-10）