鼠源乳腺癌多藥耐藥細胞株的建立及耐藥機制的初步研究

鄧印根　張志杰　盧敏瑩　賈小婷　彭　聰　賀智敏廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所　廣州市惡性腫瘤治療轉化醫(yī)學重點實驗室，廣東廣州　510095

鼠源乳腺癌多藥耐藥細胞株的建立及耐藥機制的初步研究

鄧印根張志杰▲盧敏瑩賈小婷彭聰賀智敏
廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所廣州市惡性腫瘤治療轉化醫(yī)學重點實驗室，廣東廣州510095

目的 構建鼠源性乳腺癌5-氟尿嘧啶（5-Fu）耐藥細胞株，為研究乳腺癌耐藥與體內(nèi)免疫微環(huán)境的關系提供細胞模型。方法 通過體外以濃度遞增的方法誘導小鼠乳腺癌4T1細胞對5-Fu產(chǎn)生耐藥，MTS法確定其耐藥性，平板克隆檢測其增殖活性，實時定量和半定量PCR檢測其中5-Fu代謝相關酶TS、MTHFR、TK、OPRT、DPD及藥泵蛋白MDR1、MRP1的表達，通過流式細胞術檢測其周期及CD44+CD24-干細胞亞群的比例。 結果 耐藥細胞4T1/5-Fu與4T1細胞相比，4T1/5-Fu細胞對5-Fu、吉西他濱和順鉑耐藥的耐藥指數(shù)（RI）明顯升高；5-Fu合成代謝相關酶TK、OPRT表達明顯降低 （P<0.05），代謝抑制性相關酶TS、MTHFR明顯升高 （P<0.05），藥泵蛋白MDR1、MRP1表達明顯升高（P<0.05）；流式細胞術結果顯示，CD44表達明顯升高，腫瘤干細胞群增多。結論 成功構建小鼠乳腺癌多藥耐藥細胞株，耐藥發(fā)生可能與5-Fu代謝酶類、藥泵蛋白表達以及干細胞比例改變相關。

腫瘤耐藥；4T1細胞；5-氟尿嘧啶；腫瘤干細胞

乳腺癌是嚴重危害女性健康和生命的重大疾病，化學治療是乳腺癌綜合治療中不可或缺的治療方法，而不可避免的化療耐受是嚴重影響乳腺癌治療效果的瓶頸問題。乳腺癌化療耐受機制至今尚不十分明確，近年研究顯示腫瘤微環(huán)境可能在其中發(fā)揮重要作用，尤其是腫瘤的免疫微環(huán)境[1]。鑒于探討乳腺癌耐藥與微環(huán)境關系依賴于體內(nèi)研究，而長期以來采用的人源乳腺癌細胞系建立的免疫缺陷小鼠荷瘤體內(nèi)研究模型，因小鼠本身免疫缺陷的限制，無法評價免疫系統(tǒng)對耐藥的影響。因此，本研究擬建立鼠源乳腺癌細胞系（4T1）多藥耐藥模型，并體外對耐藥機制進行初步分析，為進一步體內(nèi)研究免疫微環(huán)境對化療敏感性的影響奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

小鼠乳腺癌細胞系4T1為廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所凍存保存，購自上海生命科學院細胞庫。培養(yǎng)基RPMI-1640、0.25%胰酶、胎牛血清和TRizol購自美國Invitrogen公司。MTS、逆轉錄試劑盒及Taq酶購自美國Thermo公司，SYBR Green qPCRMaster Mix購自美國Fermentas生物公司，引物由中國上海Invitrogen合成。PI染料購自美國BD公司?？故驠ITC-CD44、APC-CD24單克隆抗體購自美國Ebioscience公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及5-Fu耐藥細胞株建立4T1乳腺癌細胞采用RPMI-1640（含有10%胎牛血清）培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗時取對數(shù)生長期細胞。以濃度遞增的方法建立4T1/5-Fu耐藥細胞株。5-Fu起始濃度為1 ng/mL，最后直到細胞在含5-Fu 100 ng/mL培養(yǎng)基中呈指數(shù)生長，歷時12個月，得到耐藥細胞系命名為4T1/5-Fu。

1.2.2細胞藥物敏感性實驗（MTS）收集對數(shù)生長期細胞，計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24 h后加入不同濃度的藥物處理細胞，置于培養(yǎng)箱中孵育48 h后，每孔加入MTS（5 g/L）20μL，混勻后在培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后在酶標儀上測定波長490 nm吸光度值（A490）。根據(jù)所測吸光度值計算出藥物各濃度處理組的生存率及抑制率，并通過藥物濃度和其抑制率的直線回歸方程，得出耐藥細胞系和親本細胞系對藥物的IC50值，計算細胞耐藥指數(shù)（RI）=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.3半定量PCR與實時熒光定量PCR提取細胞總RNA，參照Thermo的逆轉錄試劑盒和PCR擴增操作說明進行逆轉錄和PCR擴增。PCR條件為：98°C預變性2 min；98°C變性10 s，60°C退火10 s，72°C延伸50 s，循環(huán)28次；72°C再次延伸7 min，4°C無限循環(huán)。Real-time PCR：反應條件為：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火30 s，68℃延伸90 s，循環(huán)42次；72℃再次延伸10 min。依據(jù)2-△△Ct算法分析熒光定量PCR結果。各基因引物序列見表1。

表1　各基因引物序列

1.2.4細胞平板克隆實驗取對數(shù)生長期的細胞，消化懸浮成單個細胞，分別以每孔200、400、600個細胞的數(shù)目接種到6孔板中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周，當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗3次，再用甲醇固定30 min，去掉固定液，加1 mL結晶紫，染色15 min，然后吸去結晶紫，用流水緩慢洗，空氣干燥。將6孔板置于一張帶網(wǎng)格的白紙上，用肉眼直接計數(shù)克隆，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期在對數(shù)生長期的細胞中加無血清1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，同步化。消化并收集細胞，先用PBS漂洗3次，再用預冷的70%乙醇重懸細胞，置于-20℃冰箱固定過夜。離心棄固定液，PBS漂洗2次，加500μL細胞周期PI染色溶液，常溫下避光孵育30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾細胞后，上流式細胞儀分析。

1.2.6流式細胞儀檢測CD44+CD24-亞群細胞 取對數(shù)生長期細胞，離心收集細胞，以PBS調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。充分懸浮細胞后平均分為4管，一管加入CD24-APC和CD44-FITC抗體雙染，一管加入CD24-FITC抗體，一管加入CD44-PE抗體單染，最后一管加入FITC及APC標記同型對照抗體，每106個細胞加入約10μL抗體，于冰上避光孵育30 min，離心后，用含1%胎牛血清預冷的PBS漂洗后重懸，上流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1細胞形態(tài)鏡下觀察

顯微鏡下觀察乳腺癌4T1細胞及耐藥細胞系4T1/5-Fu，可見耐藥細胞變得狹長，細胞之間連接松散，并可見偽足形成（圖1）。

圖1　顯微鏡觀察細胞形態(tài)（40×）

2.2MTS檢測4T1和4T1/5-Fu的藥物敏感性

將4T1和4T1/5-Fu細胞經(jīng)不同濃度的5-Fu、吉西他濱（GEM）、奧沙利鉑（Oxaliplatin）、順鉑（cDDP）、平陽霉素（PYM）和多西紫杉醇（Pacilitaxel）作用48 h后，繪制劑量細胞存活曲線（圖2），發(fā)現(xiàn)4T1/5-Fu相對親本細胞4T1對5-Fu、GEM和cDDP耐藥，RI分別為73.38、5.16和2.11，而對奧沙利鉑、PYM和多西紫杉醇無明顯耐藥，RI分別為1.12、1.12和0.70。見表2。

2.3流式細胞術檢測4T1和耐藥細胞4T1/5-Fu細胞周期變化

采用流式細胞術分析4T1、4T1/5-Fu的細胞周期（圖3），可見與親本4T1細胞相比，耐藥細胞4T1/5-Fu G0/G1期細胞數(shù)明顯增多 （P<0.01），S期明顯減少（P<0.01），G2/M期明顯減少（P<0.01），提示耐藥細胞4T1/5-Fu的增殖變慢，見表3。另外，在耐藥細胞4T1/5-Fu中出現(xiàn)非整倍體細胞占14.19%。

圖2　4T1和4T1/5-Fu細胞對不同藥物的生存曲線

表2　4T1和4T1/5-Fu細胞對不同藥物的IC50值（mg/L，）

表2　4T1和4T1/5-Fu細胞對不同藥物的IC50值（mg/L，）

?

2.4平板克隆實驗檢測4T1和耐藥細胞4T1/5-Fu細胞增殖變化

平板克隆實驗結果顯示，4T1細胞的克隆數(shù)目明顯多于4T1/5-Fu細胞，并且克隆的大小明顯大于4T1/5-Fu細胞（圖4），4T1/5-Fu細胞在獲得耐藥性后增殖能力和細胞群體依賴性較4T1細胞明顯下降（P<0.01）。見表4。

2.5半定量和定量PCR檢測5-Fu代謝相關酶類及藥泵蛋白的變化

通過半定量PCR及實時熒光定量PCR檢測4T1/ 5-Fu耐藥細胞與4T1細胞5-Fu代謝相關酶類：二氫吡啶脫氫酶（dihydropyridine dehydrogenase，DPD）、胸苷激酶（thymidine kinase，TK）、乳清酸磷酸核糖轉移酶（orotatephosphoribosyltransferase，OPRT）、胸腺嘧啶合成酶（thymidylate synthase，TS）、亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR）及藥泵蛋白多藥耐藥蛋白 1（multidrug resistance protein 1，MDR1）、多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）的表達變化，發(fā)現(xiàn)與4T1細胞相比，5-Fu合成代謝相關酶TK和OPRT在4T1/5-Fu細胞中表達水平明顯下降（P<0.05），抑制合成代謝相關酶TS和MTHFR在4T1/5-Fu細胞中表達水平上升（P<0.05），而分解代謝相關酶DPD在4T1/5-Fu細胞與4T1細胞中都無表達；此外，藥泵蛋白MDR1與MRP1在耐藥細胞4T1/5-Fu中表達水平上升（P<0.05），提示長期5-Fu誘導導致的5-Fu體內(nèi)合成代謝抑制，胞內(nèi)藥物濃度降低等改變參與了耐藥的產(chǎn)生，見圖5、表5。

圖3　流式細胞儀檢測細胞周期的變化

表3　4T1和4T1/5-Fu細胞周期分布比較（%，）

表3　4T1和4T1/5-Fu細胞周期分布比較（%，）

細胞　G0/G1期　S期　G2/M期4T1 4T1/5-Fu P值45.36±0.93 85.31±0.64 <0.01 45.48±0.92 14.27±0.49 <0.01 9.16±0.08 0.42±0.26 <0.01

圖4　平板克隆實驗檢測細胞增殖

表4　4T1和4T1/5-Fu細胞克隆數(shù)比較（）

表4　4T1和4T1/5-Fu細胞克隆數(shù)比較（）

細胞　接種細胞數(shù)200　400　600 4T1 4T1/5-Fu P值199±15 159±14 <0.01 359±16 243±13 <0.01 562±27 401±23 <0.01

圖5　半定量和實時熒光定量PCR檢測5-Fu代謝相關酶類及藥泵蛋白表達情況

表5　4T1和4T1/5-Fu細胞5-Fu代謝相關酶類及藥泵蛋白表達相對值

2.64T1和4T1/5-Fu細胞中CD44+CD24-乳腺癌干細胞亞群比例變化情況

運用流式細胞術檢測4T1細胞與耐藥細胞4T1/ 5FU中CD44+/CD24-干細胞亞群比例，結果顯示，4T1/ 5-Fu細胞中CD44+/CD24-干細胞亞群比例高于4T1細胞，并且CD44分子表達量也明顯高于4T1細胞，表明4T1/5-Fu中腫瘤干細胞比例增加（圖6）。

圖6　流式細胞儀分析乳腺癌干細胞亞群比例

3　討論

越來越多的研究提示腫瘤在機體中耐藥的產(chǎn)生，不僅需要腫瘤細胞自身改變產(chǎn)生的耐藥機制，也需要克服機體的抗腫瘤免疫效應機制[2-7]，兩者缺一不可，尤其是繼發(fā)性耐藥，化療藥物作用下腫瘤細胞與免疫微環(huán)境發(fā)生怎樣的相互作用，導致耐藥產(chǎn)生，是當前腫瘤學研究的前沿和熱點。而目前廣泛應用的裸鼠荷瘤模型，因本身小鼠的免疫系統(tǒng)缺陷，影響了體內(nèi)研究免疫微環(huán)境與耐藥產(chǎn)生關系的研究，而解決此問題亟需鼠源性的腫瘤耐藥細胞模型。

5-Fu作為化療常用藥物，常用來體外篩選多藥耐藥細胞系。5-Fu進入細胞內(nèi)一方面通過TK、OPRT等限速酶，即通過一系列的酶促反應形成活性代謝產(chǎn)物干擾DNA和RNA的合成，促進細胞凋亡[8-9]。另一方面通過體內(nèi)多種酶，如DPD等產(chǎn)生分解代謝，抑制其毒性[10-11]。另外，在細胞內(nèi) 5-Fu代謝活性產(chǎn)物FdUMP可與dUMP競爭性結合TS，使的TS失活，抑制了 DNA的合成，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖。此外MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶[12-13]，其功能包括將還原型葉酸轉變?yōu)?-甲基四氫葉酸（5-MTHF），從而使FdUMP、TS與還原型葉酸組成的三元復合物減少，削弱5-Fu的抗腫瘤作用，已有報道這兩種基因與化療的敏感性密切相關[14-16]。本研究中耐藥細胞系 4T1/5-Fu中5-Fu合成代謝限速酶TK、OPRT明顯降低，而TS和MTHFR表達升高，這些減弱了5-Fu對核酸合成的影響，可能是耐藥產(chǎn)生的重要機制之一[17-18]。而對于在4T1/5-Fu細胞和4T1細胞中都未檢測到5-Fu分解代謝關鍵酶DPD的表達，提示可能在4T1細胞中存在新的分解代謝途徑。另外，本研究發(fā)現(xiàn)細胞藥泵蛋白MDR1、MRP1表達在耐藥細胞系中明顯升高，這提示藥泵蛋白也參與了耐藥的產(chǎn)生。

值得注意的是，與敏感細胞4T1相比，耐藥的4T1/5-Fu細胞在發(fā)生耐藥的同時，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)4T1/5-Fu細胞中腫瘤干細胞樣群細胞增多。多個研究證明，腫瘤干細胞是腫瘤耐藥產(chǎn)生的重要機制[19-20]，因此在體外長期藥物的篩選下，存活的多是具有干細胞特性的細胞群，其表現(xiàn)為增殖減慢，這與本研究觀察到的耐藥細胞系的細胞周期中G0/G1期細胞增多、G2/M期細胞明顯減少、細胞增殖明顯減慢等現(xiàn)象相符。而在體內(nèi)腫瘤干細胞是怎樣與免疫系統(tǒng)相互作用，躲避免疫系統(tǒng)的殺傷，亟需進一步研究，對于提高腫瘤的臨床治療效果有重要意義。

[1]Bruchard M，Mignot G，DerangèreV，et al.Chemotherapytriggered cathepsin B release in myeloid-derived suppressor cells activates the Nlrp3 inflammasome and promotes tumor growth[J].Nat Med，2013，19（1）：57-64.

[2]Fridman WH，Pagès F，Sautès-Fridman C，et al.The immune contexture in human tumours：impact on clinical outcome[J].Nat Rev Cancer，2012，12（4）：298-306.

[3]Vivier E，Ugolini S，Blaise D，et al.Targeting natural killer cells and natural killer T cells in cancer[J].Nat Rev Immunol，2012，12（4）：239-252.

[4]Seton-Rogers S.Tumour immunology：dendritic cellswitch[J]. Nat Rev Cancer，2012，12（4）：230.

[5]Ko JS，Bukowski RM，F(xiàn)incke JH.Myeloid-derived suppressor cells：a novel therapeutic target[J].Current Oncology Reports，2009，11（2）：87-93

[6]Almand B，Clark JI，Nikitina E，et al.Increased production of immature myeloid cells in cancer patients：a mechanism of immunosuppression in cancer[J].J Immunol，2001，166（1）：678-689.

[7]Bruchard M，Mignot G，DerangèreV，et al.Chemotherapytriggered cathepsin B release in myeloid-derived suppressor cells activates the Nlrp3 inflammasome and promotes tumor growth[J].Nat Med，2013，19（1）：57-64.

[8]Mattison LK，Soong R，Diasio RB.Implications ofdihydropyrimidine dehydrogenase on 5-fluorouracil pharmacogenetics and pharmacogenomics[J].Pharmacogenomics，2002，3（4）：485-492.

[9]Gardiner SJ，Begg EJ，Robinson BA.The effect of dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency on outcomes with fluorouracil[J].Adverse Drug Reactions&Toxicological Reviews，2002，21（1-2）：1-16

[10]邢洪存.5-FU代謝相關酶檢測及臨床意義[D].長春：吉林大學，2006.

[11]Longley DB，Harkin DP，Johnston PG.5-fluorouracil：mechanisms of action and clinical strategies[J].Nat Rev Cancer，2003，3（5）：330-338.

[12]Hosokawa A，Yamada Y，Shimada Y，et al.Prognostic significanceof thymidylate synthase in patients with metastatic colorectal cancer who receive protracted venous infusions of5-fluorouracil[J].Int JClin Oncol，2004，9（5）：388-392.

[13]余之剛，甄軍輝，賈紅英，等.胸苷酸合成酶，胸腺嘧啶脫氧核苷磷酸化酶及二氟嘧啶脫氫酶的表達與乳腺癌預后的相關性[J].中華醫(yī)學雜志，2006，86（22）：1558-1563.

[14]姜超，孫正，許哲，等.5-FU相關代謝酶表達與胃癌化療敏感性的關系[J].南京醫(yī)科大學學報：自然科學版，2011，31（12）：1815-1819.

[15]張為家.TGFβ2經(jīng)Snail介導的上皮-間質(zhì)轉化（EMT）在乳腺癌5-FU耐藥中的作用及機制[D].長沙：中南大學，2012.

[16]Salonga D，Danenberg KD，Johnson M.Colorectal tumors responding to 5-fluorouracil have low gene expression levels of dihydropyrimidine dehydrogenase，thymidylate synthase，and thymidine phosphorylase[J].Clin Cancer Res，2000，6（4）：1322-1327.

[17]金川，張永暉，彭美芳，等.MTHFR基因多態(tài)性與肺癌的相關性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2007，14（12）：888-891.

[18]Sohn KJ，Cmxford R，Yates Z，et al.Effect of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on chemosensitivity of colon and breast cancer cells to 5-fluorouracil and methotrexate[J].Journal of the National Cancer Institute，2004，96（2）：134-144.

[19]Calcagno AM，Salcido CD，Gillet JP，et al.Prolonged drug selection of breast cancer cells and enrichment of cancer stem cell characteristics[J].Natl Cancer Inst，2010，102（21）：1637-1652.

[20]Dean M.ABC transporters，drug resistance，and cancer stem cells[J].Mammary Gland BiolNeoplasia，2009，14（1）：3-9.

Establishment of mouse breast cancer multidrug resistant cell line and prelim inary study on the resistant mechanism

DENG YingenZHANG Zhijie▲LU MinyingJIA XiaotingPENG CongHE Zhimin
Cancer Center and Cancer Research Institute,Cancer Hospital,Guangzhou Medical University Guangzhou Cancer Treatment Key Laboratory of Translational Medicine,Guangdong Province,Guangzhou510095,China

Objective To construct 5-fluorouracil(5-Fu)resistant murine breast cancer cell line,in order to provide cell model for study of relationship between breast cancer multidrug resistant and immune microenvironment in vitro. M ethods 4T1 cells were exposed in stepwise escalatingconcentration of 5-Fu to develop the resistant cell line 4T1/5-Fu. And the chemosensitivity and proliferation of 4T1/5-Fu were determined by MTS and colony forming experiments,respectively.Furthermore,real-time RT-PCR and semi quantitative PCR were used to measure expression levels of 5-Fu related genes,such as TS,MTHFR,TK,OPRT,DPD,MDR1,MRP1.In addition,cell cycle and the proportion of CD44+CD24-stem cell subsets were evaluated by flow cytometry.Results Comparing to 4T1 cells,the resistance index of 4T1/5-Fu cells to 5-Fu,GEM,cDDP was increased.The results showed that compared with 4T1 cells,the expression levels of TK and OPRT were significantly decreased(P<0.05),while TS,MTHFR,MDR1 and MRP1 were remarkably increased in 4T1/5-Fu cells(P<0.05).Flow cytometry assay showed that the propotion of tumor stem cells CD44+CD24-was evidently increased in 4T1/5-Fu cells than that of 4T1 cells.Conclusion This article has successfully constructed multidrug resistant cell line 4T1/5-Fu,whose resistance may be associated with up-regulation of the 5-Fu metabolic enzymes,drug pump proteins expression and tumor stem cells percentage change.

Tumor resistance;4T1 cell;5-fluorouracil;Tumor stem cells

R329.24

A

1673-7210（2016）04（b）-0009-06

國家自然科學基金資助項目（81302291）。

鄧印根（1987-），男，碩士；研究方向：腫瘤治療耐受的分子機制。

▲

（2016-01-10本文編輯：程銘）