非洲豬瘟病毒微滴式數字PCR檢測方法的建立及臨床應用

張遠龍，王超群，黃育浩，杜 睿，李永福，王自強，李 敏，張險朋

（1.廣東省動物疫病預防控制中心，廣東廣州 510230；2.鄭州海關技術中心，河南鄭州 450000；3.東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞 523086）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病[1]?；疾∝i通常表現出體溫升高、全身出血、呼吸障礙和神經癥狀等臨床癥狀。ASF發(fā)病快，死亡率很高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大危害，對社會經濟影響大。為此，我國將ASF列為一類動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須報告動物疫病。1921年非洲肯尼亞首次暴發(fā)ASF，隨后該病傳入歐洲及美洲[2-3]。2007年，ASF傳入高加索地區(qū)，并在歐洲東部廣泛流行。2009年10月，ASF遠距離傳入俄羅斯圣彼得堡地區(qū)，疫情發(fā)生地逐漸靠近我國邊境線，引起了我國的高度重視[4]。2018年8月，我國遼寧省沈陽市首先報道了ASF疫情[5]，隨后多個省份相繼報道疫情，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重危害[6-7]。

ASFV是一種在細胞質內復制，具有囊膜的雙股DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，該屬只有ASFV 1個成員[8]。家豬和歐洲野豬對ASFV非常易感，感染后死亡率最高可達100%，不同年齡、品種和性別的豬對該病毒的易感性無明顯差別。ASFV可在野豬體內長期保存，非洲本土的野豬感染該病毒后可能會無臨床癥狀，而是作為儲存宿主使病毒在自然界中長期存在[9-10]。ASFV是目前唯一的一種DNA蟲媒病毒，廣泛分布的蜱類是其重要的儲存宿主和傳播媒介[11]。

針對ASF，目前尚無有效疫苗和治療方法[12-14]，其防控措施主要包括對發(fā)病場根除凈化和對養(yǎng)殖場實施嚴格生物安全管理措施，其中“早、快、嚴、小”的防控方案具有很重要意義。ASF診斷主要是根據臨床癥狀、流行病學調查和病理解剖變化等作出初步診斷，然后根據實驗室檢測結果進行確診，而實驗室檢測方法必須快速且結果準確。近年來，數字PCR方法在食品致病菌[15]、動物植物源性成分[16]、遺傳疾病臨床診斷[17]、感染性疾病診斷[18]等領域得到了廣泛應用，也陸續(xù)被應用于動物疫病檢測方面，先后有豬偽狂犬病[19]、豬圓環(huán)病毒2型感染[20]、豬繁殖與呼吸綜合征[21]、豬塞內卡病毒病[22]等疫病數字PCR檢測方法的報道。本研究以ASFV P72蛋白編碼基因（B646L基因）為靶基因設計引物和探針，利用正交試驗方法優(yōu)化反應體系及反應程序，建立了ASFV微滴式數字PCR方法，并對其敏感性、特異性及穩(wěn)定性進行評估，以期為預警和防控ASF提供新的檢測技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣品 100份豬全血樣品，采自東莞市中心生豬定點屠宰場，采用EDTA抗凝，-20 ℃保存；5份ASFV實驗室間比對樣品，來源于廣東省動物疫病預防控制中心。

1.1.2 標準物質和抗原 ASFVB646L基因質粒標準物質，購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，標準物質編號為GBW（E）091034，標準值為5 800 copies/μL，擴展不確定度（k= 2）為900 copies/μL。布魯氏菌抗原、偽狂犬病病毒抗原、豬圓環(huán)病毒2型抗原和豬瘟病毒抗原，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要試劑和儀器 ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）試劑盒、ddPCR droplet生成油，購自美國Bio-Rad公司；QIAamp Viral DNA/RNA Mini試劑盒，購自QIAGEN公司；ASFV熒光PCR試劑盒，購自深圳萊孚生物技術公司。PCR儀、QX200微滴數字PCR儀、DG8 cartridge微滴生成芯片、PX1熱封儀，購自美國Bio-Rad公司；ABI 7 500熒光PCR儀，購自美國ABI公司。

1.1.4 引物和探針 以ASFVB646L基因為靶向擴增區(qū)域，設計微滴式數字PCR引物和探針，引物和探針由上海生工生物工程公司合成。上游引物F：5'-TCTGCAGCTCTTACATACTG-3'；下游引物R：5'-CTTGCTCTGGATACGTTAATA-3'；探針FAM：5'-CCACTACGGAGGCAATGCGATTATT-3'-[black hole quencher（BHQ）]。

1.2 核酸提取

按照QIAamp Viral DNA/RNA Mini試劑盒說明書操作，提取臨床樣品核酸，-20 ℃保存，備用。

1.3 微滴式數字PCR反應建立

參照ddPCR Supermix for probes（No dUTP）說明書，設計反應體系（表1）及擴增程序，進行微滴式數字PCR操作。試驗流程分為4個步驟，包括PCR反應體系配置、微滴制成、普通PCR擴增和擴增微滴數值讀取。首先按照表1配置PCR反應體系，模版為ASFVB646L基因質粒標準物質或臨床樣品所提取的核酸，配置后每個反應體系總體積為20.0 μL。將配置好的每個反應體系加至準備好的微滴生成芯片（DG8 cartridge）中間一排孔中，如果檢測的數量不止8個或8的倍數時以控制緩沖液補齊。操作時吸嘴緊貼孔中一側底部，與孔壁形成一定角度，緩緩把液體打出來，打出一部分反應液時再緩緩提升吸嘴高度，直到打出所有液體，在此操作過程中不能產生氣泡。蓋上膠墊，將cartridge平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，2～3 min完成微滴生產。微滴生成在cartridge第一排孔中，用移液器緩緩吸取40 μL生成的微滴加入96孔反應板，蓋好封膜，放置于PX1熱封儀中封膜。封好膜后，將96孔反應板放入PCR儀中進行擴增。反應程序：95 ℃，10 min；94 ℃30 s，58 ℃ 1 min，40個循環(huán)；98 ℃10 min，升降溫速度≤2.5 ℃/s。PCR擴增完畢后，將96孔反應板放入微滴讀取儀中讀取結果。

1.4 反應條件優(yōu)化

利用正交試驗方法在1.3基礎上進行引物、探針濃度以及退火溫度優(yōu)化。設置不同濃度引物（0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 μmol/L）、不同濃度探針（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L）以及不同退火溫度（51、53、55、57、59 ℃），共3因素5水平25次試驗。每個試驗重復檢測3次。

1.5 特異性試驗

分別用DNA/RNA核酸提取試劑盒提取布魯氏菌、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒以及ASFVB646L基因質粒標準物質核酸，用建立的微滴式數字PCR方法進行檢測，分析方法的特異性。同時用NCBI中Blast工具對所選引物進行計算機分析。

1.6 敏感性試驗

用無核酸酶水對ASFVB646L基因質粒標準物質進行10倍倍比稀釋，共稀釋5個梯度。分別用建立的ASFV微滴式數字PCR和ASFV熒光PCR試劑盒進行檢測，每個梯度重復檢測3次，測定這2種方法的最低檢出限，并進行線性分析。

1.7 穩(wěn)定性試驗

用無核酸酶水對ASFVB646L基因質粒標準物質進行10倍稀釋，以微滴式數字PCR檢測10次，計算檢測結果的變異系數，評估該方法的穩(wěn)定性。

1.8 臨床樣品檢測

用建立的微滴式數字PCR方法和ASFV熒光PCR試劑盒對100份豬全血樣品以及5份實驗室間比對樣品進行檢測，分析豬全血樣品和實驗室間比對樣品檢測結果的符合率。

2 結果

2.1 微滴式數字PCR檢測

微滴式數字PCR檢測ASFVB646L基因質粒標準物質的結果為5 880 copies/μL，有效微滴數為16 327個，其中陽性微滴數為16 217個，陰性微滴數為110個（圖1）。該檢測結果比ASFVB646L基因質粒標準物質的標準值多80 copies/μL，偏差為1.38%，試驗結果成立。

圖1 ASFV基因質粒標準物質檢測結果

2.2 反應條件優(yōu)化

當反應體系中引物濃度為0.5 μmol/L，探針濃度為0.1 μmol/L，退火溫度為59 ℃時，微滴式數字PCR檢測可獲得最大DNA分子數，且標準偏差較?。⊿D = 3.40），陰、陽微滴熒光振幅差異明顯（圖2）。

圖2 反應條件優(yōu)化正交試驗結果

2.3 特異性試驗

以建立的微滴式數字PCR方法檢測布魯氏菌、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒和ASFVB646L基因質粒標準物質核酸，發(fā)現生成的有效微滴均在15 000個以上，只有ASFVB646L基因質粒標準物質有特異性擴增，其他病原核酸均為陰性（圖3）。使用NCBI中Blast工具，對所選引物進行除ASFV外的多種豬易感病毒核酸序列比對，結果無匹配序列；用Blast工具對所選引物和ASFV基因序列進行比對，發(fā)現匹配區(qū)域均為編碼衣殼蛋白P72的序列，表明建立的方法特異性好。

圖3 ASFV微滴式數字PCR方法特異性檢測結果

2.4 敏感性試驗

將10倍倍比稀釋的ASFVB646L基因質粒標準物質進行微滴式數字PCR檢測，每個梯度檢測3份樣品，計算每個梯度的平均值。結果（表2、圖4）顯示，生成的標準曲線為y= 1.018 2x- 0.037 4，線性相關系數（R2）為0.998 5。建立的ASFV微滴式數字PCR的最低檢測限為0.58 copies/μL，而ASFV熒光PCR檢測試劑盒的最低檢出限為58.00 copies/μL，因此微滴式數字PCR的敏感性是熒光PCR的100倍（表3）。

圖4 不同稀釋梯度ASFV B646L基因質粒標準物質檢測結果及標準曲線

表2 不同稀釋梯度B646L基因質粒標準物質檢測結果 單位：copies/μL

表3 ASFV微滴式數字PCR與熒光PCR敏感性比較結果

2.5 穩(wěn)定性試驗

用無核酸酶水對ASFVB646L基因質粒標準物質進行10倍稀釋，以微滴式數字PCR方法檢測10次，結果詳見表4、圖5。經計算，CV為8.44%，小于15%，表明重復性好。

圖5 ASFV微滴式數字PCR方法穩(wěn)定性試驗結果

表4 ASFV微滴式數字PCR穩(wěn)定性試驗結果

2.6 臨床樣品檢測

用建立的微滴式數字PCR方法檢測100份豬全血樣品，結果均為陰性，與熒光PCR檢測結果一致。檢測的5份實驗室間比對樣品中，檢測出陽性樣品4份，陰性樣品1份（表5），與實驗室間比對給定的樣品盤結果一致。

表5 實驗室間比對樣品ASFV檢測結果

3 討論

自從我國遼寧省沈陽市發(fā)生首例ASF疫情以來，2018—2020年ASF疫情報告最為集中。據統計[23]，2018年10月至2019年9月，我國種豬存欄量連續(xù)12個月同比下降超過5%，2020年7月生豬產能穩(wěn)步下降，豬肉價格同比上漲85.7%。我國是世界上養(yǎng)豬最多的國家，生豬飼養(yǎng)量占全世界一半以上。自從我國發(fā)生ASF疫情以來，我國養(yǎng)豬業(yè)受到了嚴重打擊，生豬存欄量大幅下降，肉食品供應面臨威脅。做好ASF防控，有利于養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，以及豬肉價格穩(wěn)定。

研究[24]表明，病豬在ASFV感染早期未出現明顯臨床癥狀前就已開始排毒。ASFV對外界環(huán)境抵抗力較強，在自然條件下，其在各種組織、血液和糞便中可長期保持感染性[25]。因此采用靈敏度高的方法對病毒進行早期檢測，做到早發(fā)現、早診斷、早處理，對ASF防控意義重大。

目前，ASFV診斷方法包括病毒分離鑒定、免疫熒光抗體試驗（FAT）、紅細胞吸附試驗（HAD）、普通PCR、熒光PCR（qPCR）、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）等。病毒分離鑒定是ASF診斷的金標準，是將樣品接種于細胞或試驗動物，進行病毒繁殖與分離，然后對分離的病毒進行鑒定。該方法在流行病學溯源、病原檢測，以及病毒生物學特性、病毒毒力和疫苗株研究中有很重要的作用，但其對實驗室生物安全等級要求高，一般實驗室不能開展病毒分離鑒定。FAT、HAD、PCR和LAMP方法等也可用于ASFV檢測，在各有優(yōu)勢的同時局限性也十分明顯，如操作繁瑣、敏感性不足、易交叉污染、易出現假陽性和假陰性結果等諸多問題。最新的RPA方法可在30 min內實現目的基因指數級增長，適合于屠宰場、養(yǎng)殖場和流通環(huán)節(jié)病毒快速檢測，在當前ASF防控中具有重要意義。目前熒光PCR是主流檢測方法，在養(yǎng)殖場、屠宰場和各級實驗室中得到了廣泛應用，但是該方法不能對病毒進行絕對定量檢測，且由于敏感性不足無法檢出低濃度樣本，此外，也易出現假陽性和假陰性結果[26]。數字PCR是近年來興起的第三代PCR技術，與傳統PCR相比，它是一項技術革新，通過極度稀釋實現理論上的單分子擴增，然后以終點法PCR和泊松分布計算樣品原始濃度，從而對核酸拷貝數進行絕對定量檢測。與熒光PCR相比，數字PCR不用建立標準曲線，敏感性更高，特異性更好，特別是在低濃度樣品和機體早期或潛伏期感染診斷更具有優(yōu)勢[27]。

早期研究中，原霖等[28]建立了ASFV微滴式數字PCR方法，并將其應用于臨床樣品檢測，發(fā)現其敏感性高于熒光PCR方法。本研究根據ASFVB646L基因設計引物和探針，優(yōu)化反應條件和反應體系，建立了ASFV微滴式數字PCR方法，其最低檢出限為0.58 copies/μL，穩(wěn)定性試驗的變異系數為8.44%，小于15%，重復性好；與布魯氏菌、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒等豬常見病原體無交叉反應，且在ASFVB646L基因質粒標準物質不同稀釋倍數的檢測中呈良好的線性關系。利用該方法對臨床樣品檢測未檢出陽性樣品，原因可能與樣品來源于大規(guī)模養(yǎng)殖場及樣品數量較少有關。在參加廣東省動物疫病預防控制中心組織的實驗室間比對中，使用本研究建立的微滴式數字PCR方法對比對樣品進行檢測，其結果與實驗室間比對給定的樣品盤結果一致。該方法比熒光PCR的敏感性和特異性更高，更適合ASFV早期檢測以及低濃度樣品如泔水、飼料和豬肉制品等的微量核酸檢測，其將在ASF流行病學溯源和防控中發(fā)揮重要作用。