利用C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立小鼠腦膠質(zhì)瘤模型及評(píng)價(jià)

王亞華，徐浩倫，閆荷露，李 霞，應(yīng) 雪

(新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

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利用C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立小鼠腦膠質(zhì)瘤模型及評(píng)價(jià)

王亞華，徐浩倫，閆荷露，李 霞，應(yīng) 雪

(新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

目的 利用C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立ICR小鼠動(dòng)物模型，為深入研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤中的作用提供理想的模型。方法 采用懸浮生長(zhǎng)法體外培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，用Nestin巢蛋白抗體進(jìn)行鑒別；利用C6干細(xì)胞建立ICR小鼠腦膠質(zhì)瘤模型，考察小鼠術(shù)后的生存狀態(tài)和腫瘤體積變化；通過HE染色及CD133免疫組化考察小鼠術(shù)后的病理學(xué)變化。結(jié)果 C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中Nestin表達(dá)量為96.01%，Nestin在所培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球中高表達(dá)；小鼠接種腫瘤后食欲不振，體質(zhì)量偏輕，且行為緩慢，反應(yīng)呆滯；建模21 d時(shí)腫瘤體積為(9.77±6.58)mm3；模型經(jīng)HE染色后可見腦組織呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞核皺縮，排列紊亂；免疫組化CD133染色顯示腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)顯棕色，腫瘤組織中存在大量的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。結(jié)論 利用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立的腦膠質(zhì)瘤模型成瘤率高，成瘤周期短，可作為后期腦膠質(zhì)瘤模型的理想模型。

ICR小鼠；腦膠質(zhì)瘤；動(dòng)物模型；膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；鑒別；CD133染色

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs) 是構(gòu)成腫瘤實(shí)體的異質(zhì)細(xì)胞群中含有的一些擁有自我更新能力以及分化能力的細(xì)胞群體[1]。目前，臨床主要通過腫瘤細(xì)胞減少的數(shù)量以及腫瘤體積縮小的程度來評(píng)價(jià)手術(shù)或者化療和化療對(duì)腫瘤的治療作用[2]。但是根據(jù)腫瘤干細(xì)胞理論，目前這種評(píng)價(jià)方法不能代表腦腫瘤能否完全清除。采用臨床手段治療后，如果腫瘤干細(xì)胞繼續(xù)增殖，腦腫瘤有繼續(xù)復(fù)發(fā)的可能。所以，如果能完全清除腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞，腦腫瘤就有被根治的可能。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建立小鼠膠質(zhì)瘤模型，考察腫瘤干細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤形成過程中的生長(zhǎng)情況與病理學(xué)特征，為后續(xù)研究腦腫瘤模型建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；ICR(imprinting control region)♂小鼠，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)；基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(中科邁晨科技有限公司)； DMEM/F12(美國(guó)Gibco公司)；Nestin巢蛋白抗體(美國(guó)R&D公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；0.25% 胰酶(美國(guó)Gibco公司)； FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；山羊抗兔抗體(中杉金橋生物科技有限公司)；B27因子(美國(guó)Gibco公司)；CD133抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的培養(yǎng) 將C6細(xì)胞系接種于10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗，0.25%胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液，重懸于由DMEM/F12、10 μg·L-1bFGF、20 μg·L-1EGF、體積分?jǐn)?shù)為0.02的B27因子組成的無血清培養(yǎng)基中，待腦腫瘤干細(xì)胞增殖形成腫瘤干細(xì)胞球。

1.2.2 C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的鑒定 收集C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球，采用胰酶消化，PBS 清洗細(xì)胞，4%的多聚甲醛固定10 min。體積分?jǐn)?shù)為0.001的皂苷破膜，與Nestin巢蛋白抗體以及其同型對(duì)照一起避光孵化30 min，洗滌3次后用PBS重懸，使用FACScan流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3 小鼠腫瘤模型的建立 取腫瘤干細(xì)胞球，用PBS重懸吹打至腫瘤球分散均勻，用計(jì)數(shù)板調(diào)整干細(xì)胞濃度為5×1010·L-1，將分散均勻的干細(xì)胞置于37℃水浴鍋中備用。取體質(zhì)量在18～20 g的ICR ♂小鼠，用體積分?jǐn)?shù)為0.2的氨基甲酸乙酯1 g·kg-1麻醉，將小鼠固定于腦立體定位儀上。頭頂備毛，分離暴露顱骨。根據(jù)小鼠頭部解剖圖譜確定冠狀縫前0.4 mm，矢狀縫向右2 mm，牙科鉆鉆孔。用微量注射器抽吸3 μL含有5×1010·L-1干細(xì)胞混懸液，沿骨孔緩慢垂直進(jìn)針至硬腦膜下3.0 mm，固定。緩慢注射1μL干細(xì)胞混懸液(1 min)，留針1 min，緩慢拔針，骨蠟封閉骨窗。肌注青霉素，常規(guī)單籠飼養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤模型的評(píng)價(jià) ① 觀察小鼠術(shù)后的生存狀態(tài)；② 測(cè)量腫瘤體積變化：小鼠接種腫瘤干細(xì)胞后，分別將接種成功后的d 7、14、21的小鼠，用10%的多聚甲醛固定腫瘤標(biāo)本，沿小鼠腦表面接種點(diǎn)做冠狀切口，測(cè)量腫瘤體積的大小，腫瘤體積=a2bπ/6(a為腫瘤的短徑，b為腫瘤的長(zhǎng)徑)；③ 組織學(xué)檢查：取腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本經(jīng)過石蠟包埋切片后，分別進(jìn)行HE染色及CD133免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 C6干細(xì)胞的鑒定 C6細(xì)胞接種于無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后，可形成干細(xì)胞腫瘤球體，且腫瘤球折光性強(qiáng)，干細(xì)胞腫瘤球生長(zhǎng)過程較為緩慢， 6～7 d可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過FACScan流式細(xì)胞儀分析，由Fig 1可知，與同型對(duì)照相比，C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中Nestin表達(dá)量占96%。從結(jié)果中可以看出Nestin在所培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球中高表達(dá)，說明上述培養(yǎng)條件適合干細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。

Fig 1 Identification of glioma stem cells(GSCs)

A: GSCs treated as isotype controls; B: GSCs stained with anti-mouse/rat nestin-phycoerythrin antibodies.

2.2 小鼠術(shù)后基本情況觀察 接種C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞1周后，發(fā)現(xiàn)小鼠食欲不振，體質(zhì)量偏輕，一些小鼠有不自覺的逆時(shí)針轉(zhuǎn)圈習(xí)慣，體格較弱，喜縮成一團(tuán)，且行為緩慢，反應(yīng)呆滯，眼睛半瞇，無神，卷縮近不動(dòng)，且體溫低于正常組小鼠。接種干細(xì)胞后，小鼠的中位生存期為19 d，最長(zhǎng)生存時(shí)間為26 d。

2.3 腫瘤體積變化 接種干細(xì)胞d 7、14、21時(shí)，測(cè)定腫瘤的體積分別為(0.51±8.67) mm3、(4.88±5.90) mm3、(9.77±6.58) mm3。由結(jié)果可知，腫瘤體積隨著天數(shù)的增加逐漸增大。當(dāng)建模d 21時(shí)，腫瘤體積與建模d 7和d 14相比差異有顯著性(P<0.05)。

2.4 組織學(xué)檢查 由Fig 2可知，腫瘤組織邊緣無明顯邊界，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞核皺縮，排列紊亂。在腫瘤組織中，有大面積的壞死和出血區(qū)域，并分布有豐富的微血管。由Fig 3可知，免疫組化CD133染色顯示腫瘤細(xì)胞有棕色陽(yáng)性顯色，且為胞質(zhì)著色，說明腫瘤組織中存在有大量的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是人類死亡率最高的腫瘤之一，其具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，且腦腫瘤邊緣無明顯邊界。盡管接受手術(shù)、放療、化療等手段，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍然很差，而且神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)放療和化療藥物的敏感性較差。由于腦腫瘤干細(xì)胞的存在，腦腫瘤的復(fù)發(fā)率也較高，因此腦腫瘤的預(yù)后也不理想[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了將腦腫瘤干細(xì)胞接種到小鼠腦內(nèi)的膠質(zhì)瘤模型，為后續(xù)膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)的研究奠定基礎(chǔ)。

Fig 2 HE staining of tumor tissue(×100)

Fig 3 Tumor immunohistochemical staining CD133 positive(×200)

ICR小鼠[5]是Hauschka用Swiss小鼠群以多產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行選育的小鼠。ICR小鼠具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，且生長(zhǎng)速度較快，具有較好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。ICR小鼠是進(jìn)行免疫藥物篩選，復(fù)制病理模型較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已廣泛用于藥理、毒理、腫瘤等的研究[6-7]。因此，本研究中選用ICR小鼠造模，相比較于使用大鼠造模，模型成功率高，且便于操作。將C6干細(xì)胞接種到小鼠組織中，相比較用C6細(xì)胞構(gòu)建腫瘤模型，C6干細(xì)胞較C6細(xì)胞具有更強(qiáng)的浸潤(rùn)性以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，可以更好地研究腫瘤干細(xì)胞在腫瘤生長(zhǎng)過程中的生物學(xué)特性，為后續(xù)腫瘤復(fù)發(fā)的研究提供依據(jù)。

如何從腫瘤細(xì)胞中分離純化腫瘤干細(xì)胞，也是目前的主要研究?jī)?nèi)容之一。針對(duì)腦腫瘤干細(xì)胞的分離及純化主要有以下幾種方法，即CD133免疫磁珠法、懸浮生長(zhǎng)法、SP細(xì)胞鑒定法[8]。CD133免疫磁珠法或者SP細(xì)胞操作方法復(fù)雜，成本較高，且在獲得過程中細(xì)胞數(shù)量的損耗較多，只能較少地反映干細(xì)胞的特性，而懸浮生長(zhǎng)法可以在短時(shí)期內(nèi)獲得較多以及符合建模要求的干細(xì)胞，因此本研究中選用懸浮生長(zhǎng)法來培養(yǎng)單克隆C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球。在本實(shí)驗(yàn)中，采用流式細(xì)胞儀用Nestin巢蛋白抗體對(duì)C6干細(xì)胞進(jìn)行了鑒別。由鑒別結(jié)果可知，C6干細(xì)胞的表達(dá)量較多，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的要求。

在造模過程中，分離暴露顱骨以后，應(yīng)注意保持傷口的潤(rùn)濕性，防止傷口干燥，影響小鼠后期的恢復(fù)。在注射C6干細(xì)胞的過程中，緩慢注射1 μL，留針1 min，防止干細(xì)胞在迅速拔針的過程中遺失，使細(xì)胞可以在靶部位充分沉積，延長(zhǎng)腫瘤干細(xì)胞與靶點(diǎn)腦組織的接觸時(shí)間，從而提高成瘤率[3]。

CD133是人類造血干細(xì)胞上的一種跨膜糖蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD133在白血病細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中均有表達(dá)[9-11]，表明呈CD133陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、分化以及自我更新的能力，是研究腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物的重要指標(biāo)之一。在本研究中，免疫組化選用CD133作為一抗(1 ∶50)，山羊抗兔作為二抗，結(jié)合HE染色可知，腫瘤組織邊緣呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且腫瘤組織中有大面積的壞死和出血區(qū)域，CD133在細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)。說明采用此方法建立的腫瘤模型成功。

綜上所述，本研究中使用C6懸浮生長(zhǎng)法提取了C6干細(xì)胞，利用C6膠質(zhì)瘤干細(xì)胞建造了小鼠腫瘤模型，此方法成瘤周期短且具有較高的成瘤性。通過建立腫瘤干細(xì)胞腦膠質(zhì)瘤模型，將對(duì)研究腦腫瘤產(chǎn)生的原因、腫瘤干細(xì)胞在成瘤過程中的作用機(jī)制、腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因和預(yù)防產(chǎn)生較大的影響。同時(shí)，本研究可為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤中的分子機(jī)制以及作用機(jī)制研究提供理想的模型。

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Establishment of mice model of C6 glioma stem cells and its evaluation

WANG Ya-hua, XU Hao-lun, YAN He-lu, LI Xia , YING Xue

(KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832000,China)

Aim To establish ICR animal model with C6 glioma stem cells, to provide the ideal model for the further study of glioma stem cells in brain glioma model.Methods C6 glioma stem cell was culturedinvitroby suspension,and was identified with Nestin antibody. C6 stem cells of ICR mouse glioma model were used to investigate survival state and tumor volume in mice after the operation. HE staining and CD133 immunohistochemical study were adopted to investigate the postoperative pathological changes in mice.Results The expression of Nestin was 96.01% in C6 glioma stem cells, and Nestin was highly expressed in the cultured C6 glioma stem cells. Mice were inoculated with tumor after loss of appetite, weight, behavior and slow, sluggish reaction. Tumor volume at day 21 after modeling was (9.77±6.58) mm3. After HE staining, the model showed the invasive growth, tumor cell shrinkage and derangement. Immunohistochemical CD133 staining revealed that tumor cytoplasm color was brown.Conclusion Glioma model can be established based on glioma stem cells into a high rate of tumor, the tumor cycle is short, which can be used as an ideal model for glioma.

ICR mice; brain glioma; animal model; C6 glioma stem cells; identification; CD133 staining

2016-07-05，

2016-08-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81160396，81460540)；石河子大學(xué)杰出青年科技人才培育計(jì)劃項(xiàng)目(No 2012ZRKXJQ07)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目(No 2015AD007)

王亞華(1992-)，女，碩士生，研究方向：藥物新劑型， E-mail：630579054@qq.com；

應(yīng) 雪 (1981- )，女，博士，副教授，研究方向：藥物新制劑與新劑型，通訊作者，Tel:0993-2057939,E-mail：yingxueshzu@163.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.026

A

1001-1978(2016)11-1620-03

R-332；R329.2；R363-332；R394.2；R730.264；R739.41