胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響及可能機(jī)制

吳小山，陳飛虎，葛金芳，周仁鵬，祖勝芹，朱傳君

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

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胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響及可能機(jī)制

吳小山，陳飛虎，葛金芳，周仁鵬，祖勝芹，朱傳君

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

目的 觀察胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響，研究該過(guò)程中可能機(jī)制。方法 利用酶消化法獲得原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞分為不同pH處理組(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.5和pH 6.0)以及pH6.0酸化不同時(shí)間組(0、6、12、24、48 h)，經(jīng)ROS還原劑NAC預(yù)處理的酸化組和正常組，Real-time PCR和Western blot觀察各組促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18和炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1基因和蛋白的表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基中的IL-1β、IL-18含量，AO/ EB染色和LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞的死亡情況，ROS測(cè)定試劑盒觀察細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)弱。結(jié)果 與pH 7.4組比較，酸化組的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18和炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1基因和蛋白的表達(dá)明顯增加，熒光顯微鏡觀察到ROS熒光明顯增強(qiáng)，AO/ EB染色和LDH檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸化可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞死亡，且pH 6.0酸化處理組效果最明顯；ROS還原劑NAC預(yù)處理可以明顯下調(diào)IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、caspase-1基因和蛋白的表達(dá)，并且明顯減弱軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS熒光，同時(shí)明顯下調(diào)細(xì)胞死亡率。結(jié)論 胞外酸化可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，促使軟骨細(xì)胞發(fā)生焦亡。

關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；細(xì)胞焦亡；炎癥小體；ROS；NAC

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種難治性多系統(tǒng)的免疫性疾病，累及患者的外周關(guān)節(jié)，具有較高的致殘、致畸性，對(duì)人類的健康危害很大[1]。研究表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性代謝物聚集導(dǎo)致的關(guān)節(jié)液pH值下降(可降至6.0及以下)是RA發(fā)病的主要原因之一，可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡，最終引起關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)的侵蝕與破壞等病理學(xué)改變[2]。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18等在RA關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[3]。

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是在2001年由Cookson等[4]研究發(fā)現(xiàn)的一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式。其典型特征為密切依賴于caspase-1/11的激活，并伴隨著大量促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的釋放[5]。細(xì)胞焦亡在細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征以及調(diào)控機(jī)制上均不同于自噬、凋亡和壞死等細(xì)胞死亡方式。壞死的特征包括細(xì)胞核破碎、溶解，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)成分被釋放到細(xì)胞外組織中，引起局部強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。凋亡也是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，形態(tài)學(xué)特征為細(xì)胞皺縮、核斷裂，繼而形成凋亡小體。由于凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性沒(méi)有破壞，細(xì)胞內(nèi)成分沒(méi)有被釋放到細(xì)胞外，所以很少引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。研究表明，焦亡細(xì)胞在形態(tài)上同時(shí)具有凋亡和壞死的特征，同時(shí)焦亡細(xì)胞的細(xì)胞膜也遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)被釋放到細(xì)胞外。

炎癥小體(inflammasome)是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種具有廣泛活性的輪狀結(jié)構(gòu)體，它能激活半胱天冬酶1 (caspase-1)，后者進(jìn)一步促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18切割和成熟，并且可以促使細(xì)胞發(fā)生焦亡[6]。炎癥小體主要由受體蛋白(receptor protein)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC)和效應(yīng)分子前半胱天冬酶1(pro-caspase-1)3部分構(gòu)成。文獻(xiàn)表明，細(xì)胞焦亡的發(fā)生與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如細(xì)菌感染[7]、動(dòng)脈粥樣硬化性疾病[8]、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡與一些自身免疫性疾病，例如RA的發(fā)生有關(guān)[10-12]，提示細(xì)胞焦亡可能參與了RA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本課題組的前期研究結(jié)果表明，AA大鼠存在著關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，同時(shí)胞外酸化(pH 6.0)可以明顯誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡[13]，并且存在著一定的pH依賴性。即在RA發(fā)生過(guò)程中，存在著關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的死亡過(guò)程，并且關(guān)節(jié)液中含有大量的炎癥因子，這一點(diǎn)與細(xì)胞焦亡的特征相符，但是在RA發(fā)生過(guò)程中是否存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，目前尚不清楚。

本研究將用胞外酸化過(guò)程模擬RA發(fā)生過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞所處的微環(huán)境，以大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為觀察對(duì)象，考察胞外酸化過(guò)程中是否存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的焦亡及其部分機(jī)制。進(jìn)一步闡明胞外酸化是否可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡，及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量140 g～180 g，安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：皖動(dòng)準(zhǔn)字01號(hào)。1.2 藥品與試劑 N-acetyl-L-cysteine(NAC,C5H9NO3S，分子量163.19，純度大于99%)、LDH檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；抗caspase-1 p10 抗體、抗ASC抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；抗NLRP3抗體、抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Biosynthesis公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；胎血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；大鼠IL-1β、IL-18酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自Elab Science。

1.3 原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 依照本課題組常規(guī)操作方法分離原代大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[14]。將原代軟骨細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，并接種在25 cm2透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)，48 h后觀察貼壁情況并換液。以后每隔2～3 d換1次液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底后進(jìn)行傳代處理，選取3～4代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組及藥物處理 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按照如下分組：① pH 7.4正常組、pH 7.0酸化組、pH 6.5酸化組和pH 6.0酸化組，各組細(xì)胞分別用相應(yīng)pH值的含1% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，觀察酸化對(duì)細(xì)胞焦亡的影響；② pH 7.4正常組、pH 6.0酸化6 h組、酸化12 h組、酸化24 h組和酸化48 h組，處理相應(yīng)時(shí)間后收集細(xì)胞，觀察酸化對(duì)細(xì)胞焦亡的影響；③ pH 7.4正常組、pH 6.0酸化組以及pH 6.0+NAC(10 mmol·L-1)處理組，細(xì)胞接受相應(yīng)處理后，再用pH 6.0的培養(yǎng)基處理24 h，收集細(xì)胞，觀察NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的影響。

1.5 熒光倒置顯微鏡觀察活性氧自由基(ROS)水平 細(xì)胞前處理過(guò)程依據(jù)“1.4”中分組情況，依據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟處理細(xì)胞后，于熒光倒置顯微鏡下觀察DCF的熒光強(qiáng)度，并拍照。注：DCF的熒光光譜和FITC的熒光光譜非常相似。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH水平 細(xì)胞前處理過(guò)程依據(jù)“1.4”中分組情況，96孔板分成陰性對(duì)照孔、最大酶活性孔以及藥物處理孔，并做好標(biāo)記。提前1 h在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板“最大酶活性孔”中加入20 μL LDH釋放試劑，然后輕輕吹打，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。1h后，將96孔板用離心機(jī)離心(4℃、400×g、5 min)。轉(zhuǎn)移各孔中的上清液120 μL至1塊新的96孔板中，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)吸光度。

1.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18水平 細(xì)胞前處理過(guò)程依據(jù)“1.4”中分組情況，收集各處理組細(xì)胞的培養(yǎng)基，4℃、2 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，于-80℃長(zhǎng)期保存。按照大鼠IL-1β、IL-18檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟，測(cè)定各組培養(yǎng)基上清中IL-1β、IL-18的濃度。

1.8 軟骨細(xì)胞焦亡水平檢測(cè)

1.8.1 AO/EB染色觀察軟骨細(xì)胞焦亡情況 AO/EB染料配制：AO、EB配成100 mg·L-1的儲(chǔ)備液，4℃保存，用前等量混合。軟骨細(xì)胞接種在無(wú)菌潔凈的蓋玻片上，細(xì)胞貼壁牢固給予相應(yīng)處理后，用PBS緩沖液清洗2次，在蓋玻片上滴加1滴AO/EB染料工作液染色，15 s后，用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞焦亡發(fā)生情況并拍照。

1.8.2 Real-time PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá) 細(xì)胞前處理過(guò)程依據(jù)“1.4”中分組情況，用TRIzol裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，使用核酸定量?jī)x對(duì)各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行定量，以1 000 ng總RNA每體系(體系為10 μL)，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Real-time PCR引物序列見Tab 1。反應(yīng)總體系為10 μL，其中上、下游引物各0.3 μL，2×SYBR Green 5 μL，cDNA 0.5 μL，無(wú)酶水3.9 μL。

Tab 1 Primer sequences of several genes for real-time PCR

1.8.3 Western blot法檢測(cè)軟骨細(xì)胞ASC、NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá) 細(xì)胞前處理過(guò)程依據(jù)“1.4”中分組情況，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，棄去原培養(yǎng)基,用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用熒光蛋白定量?jī)x對(duì)各組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量。加5×SDS蛋白上樣緩沖液混合后，于100℃沸水變性10 min，-20℃冰箱保存。將等量的各組總蛋白電泳分離后，電轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。用相對(duì)應(yīng)的一抗孵育過(guò)夜，接著用相應(yīng)種屬的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，然后用化學(xué)發(fā)光ECL顯影試劑盒對(duì)PVDF膜進(jìn)行曝光、顯影、拍照。Image軟件分析蛋白顯影結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡的影響

2.1.1 胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASC、NLRP3、cleaved caspase-1 蛋白表達(dá)的影響 由Fig 1 Western blot 結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASC、NLRP3、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。由pH 6.0酸化不同時(shí)間的結(jié)果可以看出，隨著酸化時(shí)間的延長(zhǎng)，ASC、NLRP3、cleaved caspase-1蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05或0.01)，且具有一定的時(shí)間依賴性。

2.1.2 胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、caspase-1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 根據(jù)Fig 2 Real-time PCR的結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞比較，pH 6.5和pH 6.0酸化組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。同時(shí)，由pH 6.0酸化不同時(shí)間的結(jié)果可以看出，隨著酸化時(shí)間的延長(zhǎng)，ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)(P<0.05或0.01)。

2.2 胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)Fig 3的結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化明顯上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，隨著pH 6.0酸化時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18水平明顯升高(P<0.05或0.01)。

2.3 胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞LDH釋放率的影響 根據(jù)Fig 4的結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化明顯上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞LDH的釋放率，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，隨著pH 6.0酸化時(shí)間的延長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中LDH水平明顯升高(P<0.05或0.01)。

Fig 1 Effects of extracellular acidosis on protein expression of ASC, NLRP3, cleaved caspase-1(n=3)

Fig 2 Effects of extracellular acidosis on mRNA expression of ASC, NLRP3, caspase-1, IL-1β,IL-18(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

Fig 3 Effects of extracellular acidosis on expression of IL-1β, IL-18 in cultured supernatants(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

2.4 胞外酸化對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響 從Fig 5的熒光倒置顯微鏡拍照結(jié)果以及熒光定量結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.5和pH 6.0酸化組軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS綠色熒光明顯增強(qiáng)，說(shuō)明酸化組軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量明顯升高。

2.5 NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 由Fig 6的熒光倒置顯微鏡拍照結(jié)果以及熒光定量結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.0酸化組軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS綠色熒光明顯增強(qiáng)，用ROS還原劑NAC(10 mmol·L-1)預(yù)處理可以明顯降低軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

Fig 4 Effects of extracellular acidosis on level of LDH in cultured supernatants(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

2.6 NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的影響

2.6.1 NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表達(dá)的影響 根據(jù)Fig 7的Western blot和Real-time PCR結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.0酸化組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18基因和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05或0.01)，用ROS還原劑NAC(10 mmol·L-1)預(yù)處理可以明顯降低軟骨細(xì)胞ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18基因和蛋白表達(dá)水平(P<0.05或0.01)。

2.6.2 AO/EB染色觀察NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡的影響 由Fig 8的熒光倒置顯微鏡拍照結(jié)果以及熒光定量結(jié)果可知，pH 7.4的正常組細(xì)胞死亡數(shù)較少，pH 6.0酸化組軟骨細(xì)胞被染成橘黃色，著色細(xì)胞比例增加，細(xì)胞死亡明顯增多，用NAC預(yù)處理可以明顯抑制軟骨細(xì)胞死亡。

2.7 NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18蛋白水平的影響 由Fig 9 ELISA檢測(cè)結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.0酸化組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18含量明顯上調(diào)(P<0.05或0.01)，用NAC預(yù)處理可以明顯降低軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18水平。

Fig 5 Effects of extracellular acidosis on expression of ROS

A:pH 7.4 group;B:pH 7.0 group;C:pH 6.5 group;D:pH 6.0 group;E:Fluorescent quantitative results.*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group

Fig 6 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of ROS

A:pH 7.4 group;B:pH 6.0 group;C:pH 6.0+NAC group;D:Fluorescent quantitative results.**P<0.01vspH 7.4 group;##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 7 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of ASC, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group;#P<0.05,##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 8 Effects of NAC on extracellular acidosis induced pyroptosis by AO/EB staining

A:pH 7.4 group;B:pH 6.0 group;C:pH 6.0+NAC group;D:Fluorescent quantitative results.**P<0.01vspH 7.4 group;##P<0.01vspH 6.0 group

Fig 9 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of IL-1β, IL-18 in cultured supernatants(n=3)

*P<0.05,**P<0.01vspH 7.4 group;#P<0.05,##P<0.01vspH 6.0 group

2.8 NAC對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞LDH釋放率的影響 由Fig 10 LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果可知，與pH 7.4的正常組細(xì)胞相比，pH 6.0酸化組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH含量明顯上調(diào)(P<0.01)，用NAC預(yù)處理可以明顯降低軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平，即用NAC預(yù)處理可以降低胞外酸化誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的死亡率。

Fig 10 Effects of NAC on extracellular acidosis induced expression of LDH in cultured supernatants(n=3)

**P<0.01vspH 7.4 group;##P<0.01vspH 6.0 group

3 討論

細(xì)胞焦亡是高度依賴于caspase-1/11激活的一種炎癥性死亡方式[15]，它通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的多種多蛋白復(fù)合物炎癥小體，廣泛參與機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)抵抗微生物入侵的過(guò)程[16]。在病理狀態(tài)下，需要2個(gè)關(guān)鍵信號(hào)的激活才能促使細(xì)胞焦亡發(fā)生，以及促炎因子的釋放：信號(hào)1，外來(lái)刺激激活膜上的模式識(shí)別受體(PRRs)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1以及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成；信號(hào) 2，外部信號(hào)促進(jìn)炎癥小體復(fù)合物的聚集和組裝，以及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的剪切成熟[17-18]。研究表明，自然界的多種物質(zhì)[19]都可以激活細(xì)胞焦亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生，例如多種細(xì)菌毒素、ATP、尿酸結(jié)晶、明礬、dsDNA、Ca2+、ROS以及氫離子[20]。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡與RA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。Kastbom等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在瑞典人群的RA患者中存在NLRP3炎癥小體基因的多態(tài)性，同時(shí)Choulaki等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)，RA患者的外周血細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)量明顯增加。此外,研究還發(fā)現(xiàn)，用藥物A20阻斷NLRP3炎癥小體、抑制其聚集和激活對(duì)RA患者的關(guān)節(jié)有一定的保護(hù)作用[12]。綜合表明在RA中存在細(xì)胞焦亡，但具體機(jī)制有待研究證實(shí)。在RA中關(guān)節(jié)部位局部組織的高度酸化是造成RA患者關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、骨質(zhì)破壞的主要因素。Rajam?ki等[21]研究發(fā)現(xiàn),胞外酸化通過(guò)促進(jìn)人巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的聚集、組裝，從而促進(jìn)其IL-1β的合成釋放。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)pH6.0酸化處理可以明顯誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡[14]。但是在RA局部組織酸化的微環(huán)境中是否存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的焦亡，尚不清楚。

本研究以原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象，利用胞外酸化處理模擬軟骨細(xì)胞所處微環(huán)境，觀察大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在用胞外酸化處理后是否發(fā)生焦亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸化處理后，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1、促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18基因和蛋白的表達(dá)明顯增加，LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LDH的釋放率均明顯增加，說(shuō)明酸化處理可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞死亡。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)量也明顯上調(diào)。以上結(jié)果提示胞外酸化刺激可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生焦亡。

活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的第二信使分子，具有極為重要的生物學(xué)活性和功能，例如氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[22]。細(xì)胞內(nèi)ROS主要來(lái)自于細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化過(guò)程，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ROS也由一系列酶活性產(chǎn)生，例如NADPH氧化酶。研究表明，ROS參與NLRP3炎癥小體的激活過(guò)程[23]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單核細(xì)胞暴露于NLRP3炎癥小體激活因子的情況下，可以促使ROS的生成，從而進(jìn)一步促進(jìn)氧化還原依賴的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1的激活，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。同時(shí)，體內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)，IL-1β的合成和caspase-1的激活也依賴于ROS的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，與pH 6.0酸化組比較，使用ROS還原劑NAC預(yù)處理可以明顯抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)，下調(diào)炎癥小體組成成分ASC、NLRP3、caspase-1、促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18基因和蛋白的表達(dá)，降低LDH的釋放率，AO/EB染色發(fā)現(xiàn)NAC同時(shí)也可以抑制軟骨細(xì)胞的死亡。

綜上所述，本研究證實(shí)胞外酸化的微環(huán)境可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生焦亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18，加重關(guān)節(jié)軟骨局部組織的侵蝕破壞和炎癥反應(yīng)，并且這種誘導(dǎo)作用與胞外酸化促進(jìn)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)有關(guān)。提示RA的發(fā)生、發(fā)展很可能與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡密切相關(guān)，為將來(lái)RA的治療提供了新方向。

[1] Branimir A, Miroslav M. Pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Reumatizam, 2014, 61(2):19-23.

[2] Firestein G S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis[J].Nature, 2003, 423(6937):356-61.

[3] Astry B, Harberts E, Moudgil K D. A cytokine-centric view of the pathogenesis and treatment of autoimmune arthritis[J].JInterferonCytokineRes,2011, 31(12):927-40.

[4] Cookson B T, Brennan M A. Pro-inflammatory programmed cell death[J].TrendsMicrobiol, 2001, 9(3):113-4.

[5] Lim Y, Kumar S. A single cut to pyroptosis[J].Oncotarget, 2015, 6(35): 36926-7.

[6] Gross O, Thomas C J, Guarda G, Tschopp J. The inflammasome: an integrated view[J].ImmunolRev, 2011, 243(1):136-51.

[7] Miao E A, Leaf I A, Treuting P M, et al. Caspase-1-induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intracellular bacteria[J].NatImmunol, 2010, 11(12):1136-42.

[8] Duewell P, Kono H, Rayner K J, et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals[J].Nature, 2010, 464(7293):1357-61.

[9] Suzuki H, Sozen T, Hasegawa Y, et al. Caspase-1 inhibitor prevents neurogenic pulmonary edema after subarachnoid hemorrhage in mice[J].Stroke, 2009, 40(12):3872-5.

[10]Kastbom A, Verma D, Eriksson P, et al. Genetic variation in proteins of the cryopyrin inflammasome influences susceptibility and severity of rheumatoid arthritis(the Swedish tira project)[J].Rheumatology(Oxford), 2008, 47(4):415-7.

[11]Choulaki C, Papadaki G, Repa A, et al. Enhanced activity of NLRP3 inflammasome in peripheral blood cells of patients with active rheumatoid arthritis[J].ArthritisResTher, 2015,17:257.

[12]Vande Walle L, Van Opdenbosch N, Jacques P, et al. Negative regulation of the NLRP3 inflammasome by A20 protects against arthritis[J].Nature, 2014, 512(7512):69-73.

[13]Yuan F L, Chen F H, Lu W G, et al. Acid-sensing ion channel 1a mediates acid-induced increases in intracellular calcium in rat articular chondrocytes[J].MolCellBiochem, 2010, 340(1-2):153-9.

[14]張晨晨,唐 杰,陳飛虎,等．酸敏感離子通道1a 在酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2013,29(8):1092-8.

[14]Zhang C C, Tang J, Chen F H, et al. Effects of acid-sensing ion channel 1a on acid-induced autophagy of articular chondrocytes and its possible mechanisms[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(8):1092-8．

[15]Lamkanfi M, Dixit V M. Mechanisms and functions of inflammasomes[J].Cell, 2014, 157(5):1013-22.

[16]Bergsbaken T, Fink S L, Cookson B T. Pyroptosis: host cell death and inflammation[J].NatRevMicrobiol, 2009, 7(2):99-109.

[17]Segovia J, Sabbah A, Mgbemena V, et al. TLR2/Myd88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection[J].PLoSOne, 2012, 7(1):e29695.

[18]Franchi L, Warner N, Viani K, Nunez G. Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense[J].ImmunolRev, 2009, 227(1): 106-28.

[19]Jamilloux Y, Seve P, Henry T. Inflammasomes in human diseases[J].RevMedInterne, 2014, 35(11):730-41.

[20]Oorni K, Rajamaki K, Nguyen S D,et al. Acidification of the intimal fluid: the perfect storm for atherogenesis[J].JLipidRes, 2015, 56(2):203-14.

[21]Rajamaki K, Nordstrom T, Nurmi K, et al. Extracellular acidosis is a novel danger signal alerting innate immunity via the NLRP3 inflammasome[J].JBiolChem, 2013, 288(19): 13410-9.

[22]Inoue M, Sato E F, Nishikawa M, et al. Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic life[J].CurrMedChem, 2003, 10(23):2495-505.

[23]Harijith A, Ebenezer D L, Natarajan V. Reactive oxygen species at the crossroads of inflammasome and inflammation[J].FrontPhysiol, 2014,5:352.

Effects of extracellular acidosis on pyroptosis of rat articular chondrocytes and its possible mechanisms

WU Xiao-shan,CHEN Fei-hu,GE Jin-fang,ZHOU Ren-peng,ZU Sheng-qin,ZHU Chuan-jun

(SchoolofPharmaceuticalSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Aim To study the effects of extracellular acidosis on articular chondrocytes pyroptosis and its possible mechanisms.Methods Primary articular chondrocytes were incubated in different pH and NAC. The expression of proinflammatory cytokines IL-1β, IL-18, ASC, NLRP3, caspase-1 were detected by Western blot and real-time PCR. The state of pyroptosis was identified by AO/EB staining and LDH contents. The expression of ROS was observed by DCFH-DA, and ELISA was used to detect the IL-1β,IL-18 in cultured supernatants.Results Compared with the normal cell, extracellular acidosis could increase the expression of IL-1β, IL-18, ASC, NLRP3 and caspase-1, upregulate the fluorescence intensity of intercellular ROS, accompanied with the promoted release of LDH. Moreover, it is observed that extra-cellular acidosis could also induce chondrocytes death by AO/EB staining. NAC，the scavenger of ROS could inhibit these effects of extracellular acidosis on chondrocytes.Conclusion Extracellular acidosis may induce chondrocyte pyroptosis via upregulating the intracellular ROS content.

arthritis; articular chondrocytes; pyroptosis; inflammasome; ROS; NAC

2016-07-13,

2016-08-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81271949，30873080)

吳小山(1991-)，男，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail:wxsahmu@sina.com；

陳飛虎(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)與分子藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:cfhchina@sohu.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.022.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.011

A

1001-1978(2016)11-1531-09

R-332；R322.72；R329.25；R392.12；R593.22