DNA片段分選微流控芯片發(fā)展現(xiàn)狀

李哲煜 孫凱 張笑顏 劉紹琴 江雷 任南琪

摘 要 新一代測序速度越來越快，費(fèi)用不斷降低，但整個(gè)流程中還有不少瓶頸。最耗時(shí)且影響測序準(zhǔn)確度和重復(fù)性的環(huán)節(jié)之一，就是在文庫制備過程中，對打斷的大量基因組DNA片段進(jìn)行基于傳統(tǒng)凝膠電泳的手工操作篩選。近幾年市場上出現(xiàn)了幾種目標(biāo)片段自動(dòng)分選儀器，并迅速被多家國際知名測序中心引入測試，從而引起了廣泛關(guān)注。本文評(píng)述了DNA片段分選發(fā)展經(jīng)歷，包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、特別是微流控芯片在分選精度和通量上的不斷提升，并簡要論述了DNA分選目前尚存在的問題。

關(guān)鍵詞 毛細(xì)管電泳； 微流控芯片； 片段分選； DNA測序； 基因表達(dá)； 綜述

1 引 言

近年來，通過污染物對生物細(xì)胞水平的毒理學(xué)機(jī)理研究，以及對基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響的機(jī)理研究，并建立它們之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)疾病的早期預(yù)防、診斷和治療成為研究熱點(diǎn)[1，2]。因此，基因表達(dá)和測序?qū)嶒?yàn)量不斷增大，從而對提升實(shí)驗(yàn)儀器自動(dòng)化效率的需求也隨之增加。圍繞這一背景需求，各國政府均投入巨額資金以應(yīng)對新一輪的環(huán)境危機(jī)和對生命體健康以及未來人類生存的影響，由此產(chǎn)生的高科技核心技術(shù)以及相關(guān)產(chǎn)品市場化競爭日趨激烈。其中，測序技術(shù)和基因表達(dá)分析技術(shù)領(lǐng)域得到了空前的發(fā)展。

新一代測序技術(shù)雖然大大提高了測序速度，降低了測序費(fèi)用，但整個(gè)流程中仍然存在不少瓶頸，限制了它的通量。其中，在文庫制備過程中對打斷的基因組DNA片段進(jìn)行手工篩選（分選，即分離+目標(biāo)篩選）就是重要瓶頸之一。

本文論述了DNA片段分選從凝膠電泳、毛細(xì)管電泳，到微流控芯片電泳的發(fā)展歷程與各自的技術(shù)特點(diǎn)，并特別闡述了DNA片段的儀器化發(fā)展以及未來發(fā)展前景。

2 凝膠電泳與切膠回收

目前，DNA片段分選普遍使用的是基于凝膠電泳分離的篩選方法（手工切膠分選法），即從凝膠電泳分離后的瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺凝膠中切膠回收，然后加熱溶解、純化目標(biāo)片段。這種方法原理簡單、材料易于獲得、操作相對簡單、成本低、回收量大，所以至今仍被廣泛使用。但是，該方法凝膠制備準(zhǔn)備時(shí)間長、消耗人力、不易擴(kuò)展；最重要的是，源自焦耳熱引起的擴(kuò)散效應(yīng)導(dǎo)致識(shí)別/分離精度低、分選準(zhǔn)確性差。分選的準(zhǔn)確性主要指，不同運(yùn)行之間、不同操作員之間的結(jié)果存在差異，基于手工操作的凝膠分選通常會(huì)有10%以上來自樣品之間交叉污染的純度誤差。操作至少需要15 s/片段。因此，對于大量重疊的片段分選，實(shí)驗(yàn)人員的手工操作很難保證準(zhǔn)確度和效率。

目前，在傳統(tǒng)凝膠電泳分選基礎(chǔ)上發(fā)展出一些新方法，如凍融離心法[1]、凝膠浸泡法[2]、改良硅藻土法[3]、電泳洗脫法、石英棉純化法[4]和海綿吸收法[5]。但是，這些方法并沒有解決凝膠電泳固有的分離精度和分選準(zhǔn)確度問題，操作仍然繁瑣、難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制、回收耗時(shí)長，如果采用專用的回收試劑盒，所需費(fèi)用較貴。因此迫切需要高精度、高效率分選法以及相應(yīng)的高度自動(dòng)化分選儀器來解決這個(gè)關(guān)鍵的瓶頸問題。

3 基于毛細(xì)管電泳與色譜技術(shù)的自動(dòng)分選

毛細(xì)管電泳技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期迅速發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)[5，6]。利用毛細(xì)管電泳技術(shù)替代凝膠電泳節(jié)省了時(shí)間，提高了分離精度。但是，目標(biāo)樣品的分選仍然是個(gè)問題。Biofocus公司在毛細(xì)管電泳后加裝了餾分收集裝置來解決這個(gè)問題（圖1a）[7]，所得到的最好分選精度達(dá)到3個(gè)堿基差。但是，每次的操作仍然很復(fù)雜，必須先做一次或多次的分析操作，以確定每一種物質(zhì)的遷移時(shí)間，并調(diào)整分離條件，使目的組分的峰之間能很好地分離，保證至少10～20 s的間隔；另外，采用的機(jī)械收集單元增大了死體積。由于毛細(xì)管電泳的檢測窗口和樣品的回收位置也就是毛細(xì)管的末端相距有一段距離（通常10 cm左右），所以目標(biāo)片段到達(dá)收集出口的時(shí)間很難準(zhǔn)確確定。Minarik等[8]為此在毛細(xì)管末端設(shè)計(jì)了兩個(gè)UV檢測器，以準(zhǔn)確計(jì)算流經(jīng)片段的速度（圖1b）。但是如果檢測點(diǎn)與回收出口不在同一點(diǎn)，誤差將是不可避免的。

為此，日立公司的研究人員在陽極回收端設(shè)計(jì)了一個(gè)石英池，在石英池內(nèi)為分離用的毛細(xì)管與收集用的毛細(xì)管之間保留了1 mm距離，檢測點(diǎn)就設(shè)置在這個(gè)1 mm的間隙處（圖1c）[9]。當(dāng)DNA片段泳動(dòng)出分離毛細(xì)管，分離電場被檢測信號(hào)觸發(fā)而斷開，DNA片段隨即利用鞘流（Sheathflow）進(jìn)入12 cm長的收集毛細(xì)管，最終回收至樣品管中。雖然該裝置的回收精度得到很大提高，但是為了達(dá)到1個(gè)堿基差的分選精度，仍需要2次PCR擴(kuò)增和共3次的分離回收。一個(gè)原因歸結(jié)為1 mm的間隙仍然太大；另一個(gè)原因是，為了收集目標(biāo)樣品而中斷分離電場導(dǎo)致了樣品斷片擴(kuò)散。Huge等[10]也引入壓力驅(qū)動(dòng)流作為鞘流，更有效地抑制了回收端的交叉污染；并加快了回收端目標(biāo)物的遷移速度，最后通過毛細(xì)管末端出口的噴嘴以液滴的形式點(diǎn)樣到96孔板，從而提高了回收效率?；谶@一系統(tǒng)，Vannatta等[11]將毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜級(jí)聯(lián)，用于分選后的進(jìn)一步分析。Minarik等[12]選擇了另一個(gè)角度，自制了一個(gè)12通道毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，并設(shè)計(jì)了一個(gè)巧妙的程控移動(dòng)回收平臺(tái)，通過優(yōu)化收集孔板的孔斷面形狀以及控制移動(dòng)速度和模式解決了收集問題（圖1d）。其分離與收集過程中不需要中斷分離電場，因此減少了毛細(xì)管中片段的擴(kuò)散。隨著收集平臺(tái)的移動(dòng)，DNA片段泳動(dòng)出毛細(xì)管直接進(jìn)入不同的收集板孔。但是，如果重疊片段較多，這樣的設(shè)計(jì)將會(huì)大大增加后續(xù)的工作量，而且由于毛細(xì)管在收集孔板上的拖行必定帶來交叉污染。

液相色譜技術(shù)為有機(jī)分子、DNA、肽和蛋白質(zhì)的分離和分選提供了一個(gè)很好的自動(dòng)化平臺(tái)。2008年，Lim等[13]用變性高效液相色譜（DHPLC）實(shí)現(xiàn)了異源雙鏈核酸的分選。但是由于精度不夠，不得不采用了兩次分選和兩次PCR。液相色譜得到的分選量比較大，但是要消耗昂貴的柱子。

圖1 基于毛細(xì)管電泳的分選方法：（a） 將ABI 310的毛細(xì)管末端單元改造，分選精度達(dá)到3 bp [7]； （b） 采用兩個(gè)光纖傳感器實(shí)現(xiàn)對快速移動(dòng)的DNA片段的定位[8]； （c） 裝置設(shè)計(jì)了一個(gè)石英塊接口與16根毛細(xì)管連接以提高通量[9]；（d） 在毛細(xì)管末端設(shè)計(jì)了一個(gè)收集DNA片段的可移動(dòng)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)采樣，以保證不丟失目標(biāo)物[12]

上述方法實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作，比傳統(tǒng)手動(dòng)人工電泳/切膠提高了效率和準(zhǔn)確度，但是仍然存在不足，這主要是因?yàn)槭艿奖旧砻?xì)管一維（1D）分離系統(tǒng)的限制，不能做到目標(biāo)分選的實(shí)時(shí)性檢測與處理，一些環(huán)節(jié)增大了死體積，導(dǎo)致了交叉污染。

4 電泳分選芯片

4.1 早期電泳分選芯片

隨著微機(jī)電技術(shù)（MEMS）的迅速發(fā)展，生物芯片的出現(xiàn)成為了近年來高新技術(shù)領(lǐng)域中極具時(shí)代特征的重大進(jìn)展，是物理學(xué)、微電子學(xué)與分子生物學(xué)綜合交叉形成的高新技術(shù)。而近10年發(fā)展起來的電泳芯片已經(jīng)成為第二代生物芯片/微流體芯片（微陣列芯片為第一代生物芯片）的主要成員之一。借助微泵、微閥和微混合器等集成元件的設(shè)計(jì)、加工和應(yīng)用，微流控芯片越來越完善[14～16]。利用微流控電泳芯片不僅可以進(jìn)行DNA長度分析，甚至可以進(jìn)行序列分析和基因分型等研究[17～21]。2001年，F(xiàn)ootz等[22]首次利用電泳芯片嘗試了分離去除PCR產(chǎn)物中的引物和二聚體（圖2a）。因?yàn)橥ǔＲ锏拈L度相對特定產(chǎn)物很短，所以研究人員利用十字電泳的樣品加載流路首先分離出引物，而只讓產(chǎn)物進(jìn)入分離流路部分；或者再次在分支流路加反向電壓讓引物返回，而只剩下移動(dòng)緩慢的特定產(chǎn)物在交叉點(diǎn)附近，但是對于不同的產(chǎn)物，需要多次測試樣品加載時(shí)間對分離的影響。Effenhauser等[23，24]最早提出專用分選微流控電泳芯片（圖2b，1995年），其設(shè)計(jì)特點(diǎn)是在分離通道末端增加了一個(gè)垂直的T型回收微流路，使目標(biāo)片段和前后的非目標(biāo)片段分時(shí)進(jìn)入兩側(cè)微流路。實(shí)驗(yàn)做了成功的分選，但是，因?yàn)槟繕?biāo)片段要等到所有片段都通過T型交叉點(diǎn)后才能遷移至目標(biāo)收集池，所以效率較低，而且在抑制非目標(biāo)片段污染方面沒有進(jìn)一步討論。Khandurina等[25]采用十字結(jié)構(gòu)替換了T型結(jié)構(gòu)，逐一分選了101， 187， 299， 427和567 bp長的PCR產(chǎn)物，該研究的最大突破是首次在分選目標(biāo)前采用了鞘流，并在分選目標(biāo)時(shí)拉后分離中的其它片段，以實(shí)現(xiàn)非目標(biāo)抑制（圖2c，2002年）。但是，該研究采用的分選模式共用了一段回收流路和回收池，這既增加了污染的可能性，又降低了效率。Khandurina等也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)問題，因此在論文最后提出了一個(gè)多目標(biāo)捕獲的設(shè)想，而實(shí)際上這個(gè)設(shè)想的實(shí)現(xiàn)還需要進(jìn)一步的污染抑制設(shè)計(jì)。從另外的角度，為了增大樣品片段峰間距，減少由于片段間重疊造成的交叉污染，Khandurina等[26]將毛細(xì)管接到十字結(jié)構(gòu)芯片上以提高分離精度（圖2d），但是毛細(xì)管與芯片微流路的對準(zhǔn)是非常困難的，同時(shí)也形成了一定的死體積，這一探索也因此沒有被后來的研究者們采用。

圖2 早期用于DNA片段分選的毛細(xì)管電泳芯片：（a）利用電泳芯片的十字進(jìn)樣結(jié)構(gòu)分離去除PCR產(chǎn)物中的引物和二聚體[22]；（b）最早的采用了T型回收單元的電泳分選芯片[24]；（c）分離末端采用十字結(jié)構(gòu)的分選芯片[25]；（d）將毛細(xì)管和分選芯片相結(jié)合以提高分離精度從而抑制片段間交叉污染[26]

4.2 非目標(biāo)片段抑制方法

隨著分選芯片研發(fā)的不斷深入，研究人員意識(shí)到交叉污染抑制的重要性，因?yàn)檫@已經(jīng)影響到分選芯片的實(shí)際應(yīng)用效果。上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所的李剛等[27]采用垂直于分離流路配置多條平行回收流路的方法，嘗試了回收流路的錯(cuò)位與直對布局，并優(yōu)化了回收流路口形狀，從而較好地抑制了片段通過垂直流路后的變形，并因此增加了回收率（圖3a）。2003年，密執(zhí)安大學(xué)Lin等[28]采用了類似Khandurina的簡單的末端十字結(jié)構(gòu)，但是改變了分選工作模式，定義的回收流路垂直于分離流路，而且在芯片上集成了分離用電極，并同時(shí)在十字流路內(nèi)內(nèi)置了微電極，用于抑制非目標(biāo)片段，以及捕捉目標(biāo)片段并將其遷移至回收流路內(nèi)。Lin等[29]在2005年進(jìn)一步優(yōu)化了內(nèi)置電極的結(jié)構(gòu)，從而使非目標(biāo)片段通過垂直流路時(shí)的拖尾現(xiàn)象得到很好的抑制（圖3b）。上述幾個(gè)研究都采用了仿真軟件模擬了回收結(jié)構(gòu)處的電場分布，這對優(yōu)化設(shè)計(jì)起到了極大作用。但是，這些研究的結(jié)果仍有一定的局限，最主要的問題是分離介質(zhì)采用了交聯(lián)凝膠，所以片段遷移慢， 分選效率低，這些結(jié)構(gòu)在非交聯(lián)介質(zhì)中的作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

上述研究表明，導(dǎo)致非目標(biāo)片段通過垂直回收流路的變形和拖尾的原因，來自電場分布的變化以及分子擴(kuò)散。因此減小回收流路的寬度是一個(gè)非常簡單有效的辦法，但是只要這個(gè)流路存在，影響就不會(huì)消失。Sweedler研究組與Beckman公司合作[30，31]，在分離末端的十字結(jié)構(gòu)上做了改進(jìn)，如圖3c所示，芯片將分離的十字電泳微流路與回收流路分置在上下兩層基板，在二者的交叉點(diǎn)通過一層6～10

SymbolmA@ m厚的200 nm孔徑聚碳酸酯納米濾膜連接。這樣的結(jié)構(gòu)與鞘流控制電壓配合有望做到污染最小化，但是納米通道及其附近的電場分布，以及膜抗污染性能測試需要進(jìn)一步討論。

對比上述復(fù)雜的內(nèi)置微電極和微流路結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，鞘流是最簡單有效的方法，而且該方法在流式細(xì)胞儀和十字電泳進(jìn)樣中都有應(yīng)用[32～34]。圖3d給出了采用和不采用鞘流時(shí)，非目標(biāo)片段進(jìn)入垂直回收流路的熒光檢測結(jié)果，并通過在分選交叉點(diǎn)前后以及兩側(cè)設(shè)置多個(gè)熒光檢測點(diǎn)，記錄了目標(biāo)片段分選時(shí)各點(diǎn)的熒光變化，清楚地反映了目標(biāo)片段捕捉的效果[35]。在我們的進(jìn)一步研究中，通過對回收后的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及分離分析，確認(rèn)了鞘流有無時(shí)，非目標(biāo)片段對目標(biāo)片段污染的定量分析[36]。

圖3 采用不同的微結(jié)構(gòu)減少DNA片段在回收流路前的擴(kuò)散與交叉污染： （a） 特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以保證最大量的采樣，減少樣品損失，并控制片段變形[27]； （b） 兩個(gè)十字交叉結(jié)構(gòu)，一個(gè)用于進(jìn)樣，另一個(gè)用于分選。在分選通道附近設(shè)計(jì)了微電極結(jié)構(gòu)用于控制DNA片段流經(jīng)時(shí)的形狀，減小片段變形[29]； （c） 采樣通過垂直的具有納米通道的薄膜，最大程度的減少了片段經(jīng)過時(shí)變形[30]； （d） 通過控制回收流路兩側(cè)的偏壓，形成鞘流以阻擋非目標(biāo)物對回收流路的污染。在分離流路前后與采樣流路入口設(shè)置熒光信號(hào)采樣，右下角插圖顯示20bp 片段從10bp dsDNA ladder 中成功分選，分選后在分離流路中已經(jīng)看不到該片段[35]

4.3 高通量分選

提高通量是微流控芯片研發(fā)最重要的目標(biāo)。隨著材料和微加工技術(shù)的發(fā)展，毛細(xì)管電泳分離芯片的集成度越來越高，其高通量實(shí)現(xiàn)方式可分為并行和串行。并行分離通道已經(jīng)從4通道[37]、10通道[38，39]，迅速發(fā)展為12通道[40]。在串行方面，Agilent 2100系統(tǒng)一次上樣最多達(dá)到12個(gè)，然后依次分離；Caliper公司研發(fā)的GX系列則借助芯片上的連續(xù)提取毛細(xì)管，將連續(xù)通量擴(kuò)展為96或者384，不僅解決了分離介質(zhì)更換，還延長了芯片的使用壽命，降低了消耗成本；此外，光學(xué)單元的成本也低于并行檢測系統(tǒng)；但是，串行效率不如并行高。需要指出的是，上述高通量分離芯片的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)并不完全適用于分選。

高通量分選，即指多目標(biāo)的分離回收。隨著通量的增加，不僅需要在芯片上增加大量流路和樣品池，有時(shí)甚至需要在芯片上集成大量微閥和微泵單元，所以芯片集成度隨之增加，這導(dǎo)致芯片的設(shè)計(jì)越來越困難，外圍檢測控制單元也越來越復(fù)雜，系統(tǒng)成本也大幅增加。更重要的是，高通量下樣品間的交叉污染問題也越來越難避免。這些因素都是分離芯片研究未遇到的問題。

目前，最經(jīng)濟(jì)有效的方式是通過一次分離，相繼順序回收被分離的多個(gè)目標(biāo)片段。如圖4a，本研究組在鞘流流路與分離流路相連接的回收流路上布置了多個(gè)回收流路分支，并將激光聚焦在回收流路口，在檢測到目標(biāo)樣品后，通過切換電場操控目標(biāo)片段進(jìn)入對應(yīng)的回收流路[35]。但是，不同于單一片段分選，多目標(biāo)片段分選芯片有多個(gè)回收流路分支，目標(biāo)片段進(jìn)入對應(yīng)的分支之前會(huì)對其它分支產(chǎn)生污染，因此，簡單的鞘流已經(jīng)不能對所有的回收分支流路起到保護(hù)作用。為此，我們在目標(biāo)片段進(jìn)入對應(yīng)樣品回收池后，增加了對被污染分支流路的沖洗操作，即將進(jìn)入“錯(cuò)誤”流路的片段移出并送至對應(yīng)目標(biāo)樣品池。對于多目標(biāo)分選，回收的次序是需要嚴(yán)格設(shè)計(jì)的，以圖4a為例，目標(biāo)片段進(jìn)入的次序是先外側(cè)再內(nèi)側(cè)，即7980。但是，這樣的設(shè)計(jì)操作略顯繁瑣，而且提取回收樣品時(shí)容易出錯(cuò)，為后續(xù)工作增

圖4 多目標(biāo)片段分選芯片：（a）共用回收流路的4目標(biāo)分選芯片，給出了清晰的分選流程和片段移動(dòng)方向[35]；（b）隔離型3目標(biāo)分選芯片及回收后電泳圖譜[41]；（c）采用樹狀、星形和36通道的高通量分選芯片[42]；（d）以實(shí)現(xiàn)連續(xù)回收為目的，采用圓周分布型的多目標(biāo)回收結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，樣品經(jīng)過3.5 cm的分離后，在鞘流的作用下連續(xù)掃過回收流路[44]

加了隱患；因?yàn)榕c分離流路垂直的回收流路成為了共用流路，所以也成為了交叉污染的隱患。為此，在進(jìn)一步的研究中，將回收流路全部平行隔離開，以減少彼此共用部分（圖4b）[41]。最上面的回收流路也是鞘流流路，熒光實(shí)驗(yàn)證明

優(yōu)化后的鞘流可以保護(hù)下面兩個(gè)流路，自下而上依次回收的片段長度為35， 108和138 bp，其純度為99.3%， 97.9%和94.7%。雖然純度都很高，在后續(xù)的測序當(dāng)中也沒有發(fā)現(xiàn)異常，但是在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，純度呈下降趨勢。深入分析發(fā)現(xiàn)，主要原因是分選前一個(gè)目標(biāo)時(shí)，主分離流路中的樣品由于電場作用停止而增大了擴(kuò)散，同時(shí)DNA分子不再是拉直狀態(tài)，分離精度因此下降；另外DNA分子與管壁的吸附也需要考慮。為了解決上述問題，Harrrison課題組[42]加寬了鞘流后的流路，減少了樣品與回收流路的接觸，以達(dá)到降低污染的目的（圖4c）。該研究最大推出了36通道分選芯片，但是作者未對全部通道的回收樣品做對應(yīng)的純度分析，如果該設(shè)計(jì)能夠保證高通量下的低污染將非常有意義。2013年，該課題組進(jìn)一步研發(fā)了用于蛋白組學(xué)研究的樣品分選、富集和洗脫的6通道以及8通道芯片[43]。圖4d則進(jìn)一步縮短了鞘流后的流路長度，并將回收流路呈圓周狀布置，使電場分布更一致，同時(shí)最大程度提高了通量；設(shè)計(jì)最大優(yōu)點(diǎn)是，在分選過程中，主分離流路電場不需要切斷，片段被連續(xù)依次送入回收流路[44]。這個(gè)設(shè)計(jì)原理與前面圖2d的機(jī)械連續(xù)運(yùn)動(dòng)方式回收機(jī)構(gòu)相似，優(yōu)勢是采用了快速的電掃描方式，不足是通量不足以應(yīng)對尺寸接近或者重疊片段分選。

雖然上述設(shè)計(jì)具有了很大改進(jìn)，但是在復(fù)雜目標(biāo)分選過程中，尤其是重疊片段分選問題仍然沒有解決。2009年。本研究組實(shí)現(xiàn)了單堿基差的3個(gè)部分重疊的單一目標(biāo)片段分選[45]，相繼回收的3個(gè)片段的純度均超過90%，部分達(dá)到99%，至此，將分選精度推到了極限。但是分離時(shí)間超過40 min，而且僅能做單一目標(biāo)分選。本研究組根據(jù)采樣定理設(shè)計(jì)了一款新的芯片，采用10條間距為100 μm的回收流路構(gòu)成采樣區(qū)，在樣品片段進(jìn)入采樣區(qū)后，10條回收流路同時(shí)回收采樣區(qū)內(nèi)的樣品（圖5a）。采用新芯片僅用10 min就實(shí)現(xiàn)了單堿基差重疊片段樣品的分選[46]；而且一次采樣成功回收了相鄰的兩個(gè)片段[47]。這種方法改變了以往斷片回收以分離精度為必要條件的限制，大大縮短了分離時(shí)間，提高了效率。

圖5 幾種新穎的多目標(biāo)片段分選芯片：（A）運(yùn)用采樣定理的同時(shí)空間分選芯片[47]；（B）具有棱鏡式分離性能的DNA大分子分選結(jié)構(gòu)[48]；（C）可分離兩種混合物的二維自由流電泳芯片[49]

以往的DNA片段回收量少，所以必須通過PCR對回收樣品進(jìn)行濃度擴(kuò)增，這無疑增加了后續(xù)工作量。2002年，Huang等[48]以2 μm圓柱矩陣為分離介質(zhì)的雙向電泳芯片，新穎結(jié)構(gòu)的作用如同光散射棱鏡，將長度為61， 114， 158和209 kb的大分子DNA片段呈不同角度分離開，并在末端實(shí)現(xiàn)連續(xù)回收（圖5b）。同樣采用連續(xù)流分離回收方式，日本NEC公司與BABA研究組合作，將分離柱直徑從2 μm降到了200 nm以下，柱間縫隙僅約為32 nm寬，以此將回轉(zhuǎn)直徑57 nm的300 bp DNA片段和回轉(zhuǎn)直徑22 nm的100 bp DNA片段通過不同通道分別回收[49]。納米柱或者納米壁形成的矩陣在分離過程中可以拉長核酸分子[50，51]，這對于核酸大分子分離和回收具有極大潛力，甚至有望推動(dòng)實(shí)現(xiàn)DNA單分子測序。2009年，Zalewski等[52]設(shè)計(jì)了另一款二維自由流電泳芯片，通過調(diào)控3個(gè)輸入和5個(gè)輸出端的交流電場，以連續(xù)流的方式將兩個(gè)混合的樣品送入不同的輸出端（圖5c）。這兩個(gè)研究的突出優(yōu)點(diǎn)是解決了DNA大分子的連續(xù)多目標(biāo)分選，而且連續(xù)分選可以獲得大量富集，而無需以往方法的PCR濃度擴(kuò)增。

4.4 商用分選儀器

2010年，美國Caliper LifeSciences公司推出了Labchip XT自動(dòng)化核酸回收儀器，使用的是4或5通道一次性芯片，工作流程與前面的研究團(tuán)隊(duì)也基本一致。通過芯片采用的試劑盒和芯片設(shè)計(jì)可以看出，Caliper公司并沒有采用芯片電泳的經(jīng)典十字進(jìn)樣設(shè)計(jì)，分離介質(zhì)與分離原理與凝膠電泳類似，這說明該產(chǎn)品更強(qiáng)調(diào)回收量，以此減少PCR擴(kuò)增帶來的成本增加和問題復(fù)雜化。但是，這也同時(shí)繼承了凝膠電泳的缺點(diǎn)，精度低僅為5 b/bp；分離回收時(shí)間長，快的需要30 min完成，有的甚至長達(dá)50～100 min。

值得提出的是，Labchip XT所提出的非液相接觸式電極，避免了前后兩塊芯片之間通過電極產(chǎn)生的交叉污染。其解決辦法是在芯片上再內(nèi)置一套金屬電極，內(nèi)置電極與緩沖液接觸。另外值得稱贊的是，產(chǎn)品軟件設(shè)計(jì)嚴(yán)密，確保了大部分分選的重復(fù)性，節(jié)省了人力，提高了效率。從其設(shè)計(jì)可以看出，單通道原則上一次只能回收一個(gè)目標(biāo)片段，雖然系統(tǒng)設(shè)計(jì)提供了“Extraction and Pause”功能，在手動(dòng)提取第一個(gè)目標(biāo)片段后，可以繼續(xù)執(zhí)行下一個(gè)目標(biāo)片段的分選，但是之間要對回收池進(jìn)行手動(dòng)清洗，以避免樣品間的交叉污染。這大大限制了效率的提高。

上述儀器雖然仍存在很多不足，但是自動(dòng)化分選仍使很多新一代測序用戶接受了這一產(chǎn)品，實(shí)際使用表明，使用自動(dòng)化樣品制備平臺(tái)，配合核酸電泳分離分析設(shè)備，能夠?qū)⑷怙@子捕獲及提高相應(yīng)測序文庫構(gòu)建的效率，在確保最終測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的前提下，從原本人工操作時(shí)的每周每人12樣提升至每周每人200 樣以上。但是，對復(fù)雜的具有重疊片段的分選，目前市場上的儀器仍無法進(jìn)行高精度高重復(fù)性的分選。另外需要指出的是，與成千上萬的目標(biāo)片段相比，僅4或5個(gè)通道的分選還是顯得不足，而且樣品提取后沒有純度分析，自動(dòng)化的優(yōu)勢因此遜色不少。

5 結(jié) 語

綜上所述，雖然分選方法在不斷改善，精度在不斷提高，但是快速實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度、高通量和高純度的自動(dòng)化分選和各種復(fù)雜目標(biāo)峰的分選與定量，是目前科研人員面對的新挑戰(zhàn)，主要包括：（1）高電場下快速移動(dòng)片段的準(zhǔn)確捕捉 細(xì)小的流路使更高電場的使用成為可能，因此片段的遷移速度更快，分選過程的完成將得到速度提升。因此需要新的方法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的捕捉，而又避免相鄰片段的污染。（2）重疊片段的準(zhǔn)確分選方法 即使良好的分離也不能完全避免重疊片段的出現(xiàn)，而良好的分離往往需要更長的分離距離和時(shí)間。因此研究新的分選方法實(shí)現(xiàn)短距離分離、在重疊狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)高純度分選非常重要。（3）實(shí)用化高通量分選方法 這是提高處理能力和效率，應(yīng)對實(shí)際需求必須面對的問題。需要解決的主要是芯片設(shè)計(jì)和檢測方法。（4）建立分選原位分析于一體的自動(dòng)化體系 單獨(dú)的自動(dòng)化分選儀器可以解決上述瓶頸問題，但在多數(shù)情況下，分選后的樣品仍需擴(kuò)增富集和純度分析，兩個(gè)流程之間不可避免的手工操作犧牲掉了剛剛獲得的優(yōu)勢，同時(shí)增加了樣品被污染的幾率。所以實(shí)現(xiàn)完整的自動(dòng)化流程非常重要。

該領(lǐng)域的研究屬于生物芯片發(fā)展前沿，同時(shí)我國在以生物工程、分子生物學(xué)等為代表的生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，對各種對象的微量分選制備存在迫切需求。因此，對國內(nèi)的科研工作者而言，以微流控芯片為載體，充分利用微流控芯片設(shè)計(jì)在二維空間的延展，發(fā)揮它在集成化、最小化、低樣品試劑消耗、高效率、實(shí)時(shí)檢測等方面的優(yōu)勢，對建立具有國際競爭力的高端篩選儀器體系和品牌具有積極作用。

References

1 Ding L， Stilwell J， Zhang T， Elboudwarej O， Jiang H， Selegue J P， Cooke P A， Gray J W， Chen F F. Nano Lett.， 2005， 5（12）： 2448-2464

2 Heidi L. Nature， 2008， doi：10.1038 /news. 2008.439

3 Collins F S， Morgan M， Patrinos A. Science， 2003， 300（5617）： 286-290

4 Fukumura R， Takahashi H， Saito T， Tsutsumi Y， Fujimori A， Sato S， Tatsumi K， Araki R， Abe M. Nucleic Acids Res.， 2003， 31（16）： e94-e94

5 Kostal V， Katzenmeyer J， Arriaga E A. Anal. Chem.， 2008， 80（12）： 4533-4550

6 Kodzińska E， Buszewski B. Anal. Chem.， 2009， 81（1）： 8-15

7 Lin M， Rich R G， Shipley R F， Hafez M J. J. Mol. Diagn.， 2007， 9（5）： 598-603

8 Minarik M， Foret F， karger B L. Electrophoresis， 2000， 21（1）， 247-254

9 Irie T， Oshida T， Hasegawa H， Matsuoka Y， Li T， Oya Y， Tanaka T， Tsujimoto G， Kambara H. Electrophoresis， 2000， 21（2）： 367-374

10 Huge B J， Flaherty R J， Dada OO， Dovichi N J. Talanta， 2014， 130（1）： 288-293

11 Vannatta M W， Whitmore C D， Dovichi N J. Electrophoresis， 2009， 30（23）： 4071-4074

12 Minarik M， Kleparnik K， Gilar M， Foret F， Miller A W， Sosic Z， Karger B L. Electrophoresis， 2002， 23（1）： 35-42

13 Lim K S， Naviaux R K， Wong S， Haas R H. J. Mol. Diagn.， 2008， 10（1）： 102-108

14 Mitchell P. Nat. Biotechnol.， 2001， 19： 717-721

15 Auroux P A， Iossifidis D， Reyes D R， Manz A. Anal. Chem.， 2002， 74（12）： 2637-2652

16 Reyes D R， Iossifidis D， Auroux P A， Manz A. Anal. Chem.， 2002， 74（12）： 2623-2636

17 Harrison D J， Fluri K， Seiler K， Fan Z， Effenhauser C S， Manz A. Science， 1993， 261（5123）： 895-897

18 Woolley A T， Mathies R A. Anal. Chem.， 1995， 67（20）： 3676-3680

19 Shi Y， Anderson R C. Electrophoresis， 2003， 24（1920）： 3371-3377

20 Yi LL， Xu X Q， Lin X X， Li H F， Ma Y， Lin J M. Analyst， 2014， 139（13）： 3330-3335

21 Deng Y， Yi LL， Lin X X， Lin L， Li H F， Lin J M. Talanta， 2015， 144： 136-144

22 Footz T， Wunsam S， Kulak S， Crabtree H J， Glerum D M， Backhouse C J. Electrophoresis， 2001， 22（18）： 3868-3875

23 Effenhauser C S， Manz A， Widmer H M. Anal. Chem.， 1993， 65（19）： 2637-2642

24 Effenhauser C S， Manz A， Widmer H M. Anal. Chem.， 1995， 67（13）： 2284-2287

25 Khandurina J， Chovan T， Guttman A. Anal. Chem.， 2002， 74（7）： 1737-1740

26 Khandurina J， Guttman A. J. Chromatogr. A， 2002， 979（12）： 105-113

27 Li G， Ran R， Zhao J， Xu Y. Electrophoresis， 2007， 28（24）： 4661-4667

28 Lin R， Burke D T， Bruns M A. J. Chromatogr. A， 2003， 1010（2）： 255-268

29 Lin R， Burke D T， Bruns M A. Anal. Chem.， 2005， 77（14）： 4338-4347

30 Kuo T， Cannon D M， Chen Y， Tulock J J， Shannon M A， Sweedler J V， Bohn P W. Anal. Chem.， 2003， 75（8）： 1861-1867

31 Tulock J J， Shannon M A， Bohn P W， Sweedler J V. Anal. Chem.， 2004， 76（21）： 6419-6425

32 Bharadwaj R， Santiago J G， Mohammadi B. Electrophoresis， 2002， 23（16）： 2729-2744

33 Dittrich P S， Schwille P. Anal. Chem.， 2003， 75（21）： 5767-5774

34 Fu L M， Yang R J， Lee G B. Anal. Chem.， 2003， 75（8）： 1905-1910

35 Sun K， Li Z， Ueno K， Juodkazis S， Noji S， Misawa H. Electrophoresis， 2007， 28（10）： 1572-1578

36 Sun K， Suzuki N， Li Z Y， Araki R， Ueno K， Juodkazis S， Abe M， Noji S， Misawa H. Electrophoresis， 2008， 29（19）： 3959-3963

37 Shen Z， Liu X J， Long Z C， Liu D Y， Ye N N， Qin J H， Dai Z P， Lin B C. Electrophoresis， 2006， 27（56）： 1084-1092

38 Dang F， Shinohara S，Tabata O， Yamaoka Y， Kurokawa M， Shinohara Y， Ishikawa M， Baba Y. Lab Chip， 2005， 5（4）： 472-478

39 Dang F， Tabata O， Kurokawa M， Ewis A A， Zhang L， Yamaoka Y， Shinohara S， Shinohara Y， Ishikawa M， Baba Y. Anal. Chem.， 2005， 77（7）： 2140-2146

40 Inoue A， Ito T， Makino K， Hosokawa K， Maeda M. Anal. Chem.， 2007， 79（5）： 2168-2173

41 Li Z Y， Sun K， Sunayama M， Araki R， Ueno K， Abe M， Misawa H. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（7）： 997-1003

42 Wang Z， Justine T， Jemere A B， Harrison D J. Electrophoresis， 2010， 31（15）： 2575-2583

43 Hua Y， Jemere A B， Dragoljic J， Harrison D J. Lab Chip， 2013， 13（13）： 2651-2659

44 Baker C A， Roper M G. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（28）： 4743-4748

45 Sun K， Suzuki N， Li Z Y， Araki R， Ueno K， Juodkazis S， Abe M， Noji S， Misawa H. Electrophoresis， 2009， 30（24）： 4277-4284

46 Li Z Y， Sun K， Sunayama M， Araki R， Ueno K， Abe M， Misawa H. Electrophoresis， 2011， 32（23）： 3392-3398

47 Sun K， Li Z Y， You S J， Zhang X Y， Ren N Q. Microfluid. Nanofluid.， 2015， 19（2）： 291-298

48 Huang R L， Jonas T O， Jessica K J， James S C， Robert A H， Cox E C. Nat. Biotech.， 2002， 20： 1048-1051

49 Hattori W， Someya H， Baba M， Kawaura H. J. Chromatogr. A， 2004， 1051（12）： 141-146

50 Yasui T， Kaji N， Ogawa R， Hashioka S， Tokeshi M， Horiike Y， Baba Y. Anal. Chem.， 2011， 83（17）： 6635-6640

51 Kazemlou S， Nazemifard N. Microfluid. Nanofluid.， 2014， 17（6）： 993-1002

52 Zalewski D R， Gardeniers H J. Electrophoresis， 2009， 30（24）： 4187-4194

Advance in Microfluidic Devices for Fractionation of DNA Fragments

LI ZheYu， SUN Kai*， ZHANG XiaoYan， LIU ShaoQin， JIANG Lei， REN NanQi

（State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment， Harbin Institute of Technology， Harbin 150090， China）

Abstract Current next generation sequencing works faster and the price is coming down. However， the workflows have numerous manual processes， which contribute to bottleneck and process inefficiency. One of the most time consuming steps is electrophoretic gelbased fractionation of a large number of fragments of interest from the library generation process. In recent years， several instruments were first introduced into the market， and then were tested soon by many famous DNA sequencing centers and platforms. This paper introduces the development of DNA fractionation techniques including capillary electrophoresis and microfluidic devices. Moreover， our argument raises the bottleneck in fractionating DNA fragments on the chips. Finally， we provide insights into the challenges of DNA fractionation and perspectives.

Keywords Capillary electrophoresis； Microfluidic chip； Fractionation； DNA sequencing； Gene expression； Review

（Received 23 July 2015； accepted 28 September 2015）

This work was supported by the State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment （No. 2011TS02）