非圖案化法制備柔性連續(xù)葡萄糖監(jiān)測(cè)傳感器

陳瑋 陳裕泉

摘 要 以聚多巴胺作為前驅(qū)體，在聚酰亞胺薄膜表面化學(xué)沉積一層牢固致密的金層，以該鍍金薄膜兩面的金層作為基體電極，在其中一面鍍鉑黑作為參比對(duì)電極，在另一面依次電沉積鉑黑層、電泳形成Nafion/碳納米管網(wǎng)絡(luò)層、電吸引形成葡萄糖氧化酶層構(gòu)成工作電極，并整體涂覆聚氨酯外膜，制備了一種柔性葡萄糖傳感器?？疾炝舜藗鞲衅鲗?duì)葡萄糖的檢測(cè)性能，以及各層表面形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)傳感器性能的影響。傳感器在0.3 V的工作電位下對(duì)葡萄糖的線性響應(yīng)范圍是2.0～32.0 mmol/L，響應(yīng)靈敏度為25 μA·（mmol/L）

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Symbolm@@ 2，檢出限為0.05 mmol/L （S/N=3），且傳感器有良好的長期穩(wěn)定性和抗干擾性，可用于皮下連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞 表面金屬化； 柔性傳感器； 連續(xù)； 血糖

1 引 言

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見慢性病之一，目前仍無法治愈，但有效的血糖管理可以大幅降低并發(fā)癥的發(fā)生率，提高患者生活質(zhì)量。連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（CGMS）的出現(xiàn)[1]，為血糖監(jiān)控提供了完整的趨勢(shì)信息，并能提供高、低血糖的報(bào)警功能，能將患者每日指血測(cè)量的次數(shù)降低到1～2次，甚至于無需指血校準(zhǔn)[2]，是繼指血血糖儀之后的又一重要發(fā)明。目前，這類傳感器通常是以柔性聚合物薄膜為基底，在其上印刷碳電極或?yàn)R射金電極，通過電極的層層組裝[3]或平面錯(cuò)位排布[4]形成電化學(xué)三電極體系；或者直接利用極細(xì)的金屬絲制作[5，6]，以金屬絲表面的絕緣層隔離工作電極與參比電極，形成二電極體系。但這些方法制作的傳感器材料成本高，工藝復(fù)雜、規(guī)?；潭鹊?，使得這類產(chǎn)品生產(chǎn)成本高，價(jià)格昂貴，制約了CGMS系統(tǒng)的推廣應(yīng)用。

近年來，仿生學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在水溶液條件下，多巴胺能發(fā)生氧化聚合，在聚合物、金屬、陶瓷、玻璃、木材等一系列固體材料表面形成一層超強(qiáng)附著的復(fù)合層。而多巴胺的鄰苯二酚基團(tuán)能夠?qū)饘佼a(chǎn)生一定強(qiáng)度的束縛力，且對(duì)金屬離子具有較強(qiáng)的還原能力，當(dāng)表面沉積聚多巴胺層的改性材料浸入金屬鹽溶液中時(shí)，復(fù)合層從溶液中還原金屬陽離子并使之沉積在材料表面，從而實(shí)現(xiàn)無電鍍的材料表面金屬化[7]。這是一種有別于光刻、絲網(wǎng)印刷、噴印、磁控濺射等技術(shù)的有機(jī)薄膜表面金屬化方法，非常適合用于構(gòu)建薄膜型電化學(xué)電極。本研究利用該技術(shù)，在聚酰亞胺（PI）薄膜表面化學(xué)沉積一層致密的金層，然后以薄膜兩面的金層分別作為工作電極與參比對(duì)電極，構(gòu)成電化學(xué)兩電極體系，形成一種單層雙面柔性薄膜電極。以此為基礎(chǔ)，在設(shè)定的工作電極表面電沉積花瓣?duì)钽K納米顆粒作為催化層；在碳納米管（CNT）的Nafion分散液中電泳吸附CNT形成CNT/Nafion網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，作為抗干擾層；并在其上通過電吸附葡萄糖氧化酶，形成酶生化敏感層；最后，在戊二醛中交聯(lián)固化后涂覆聚氨酯（PU）傳質(zhì)限制層，構(gòu)成葡萄糖檢測(cè)傳感器。制備的傳感器表現(xiàn)出良好的葡萄糖連續(xù)檢測(cè)性能，兼具柔性、微細(xì)、長期穩(wěn)定性好、抗干擾性強(qiáng)的特點(diǎn)，而此制備方法具有原材料成本低，可成板制備，切割成型，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于低成本皮下連續(xù)葡萄糖監(jiān)測(cè)傳感器的開發(fā)中。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI660E型電化學(xué)工作站（上海辰華公司）；Sirion100型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（荷蘭FEI公司）；激光切割機(jī)（深圳立華激光公司）。

聚酰亞胺（PI）薄膜（Kapton 500HN，3M公司）；聚氨酯（PU）、Nafion（5%， w/V）、牛血清蛋白（BSA）、 多巴胺鹽酸鹽（Sigma公司）；十八烷基三甲基氯化銨（STAC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；四氫呋喃（THF）、二甲基甲酰胺（DMF）、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA）、醋氨酚（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD，200U/mg）、葡萄糖、戊二醛（25% w/V）、氯鉑酸、氯金酸、硼氫化鈉、醋酸鉛、H2O2（國藥集團(tuán)上海試劑公司）；碳納米管水性分散液（7%～8%，w/V，中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司）；TrisHCl （pH 8.5）、0.01 mol/L PBS緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

2.2 聚酰亞胺薄膜表面金屬化

將清潔后的PI薄膜（10 cm × 4 cm）浸入多巴胺鹽酸鹽溶液（2 mg/mL，pH 8.5）中，室溫下緩慢振蕩24 h，使PI薄膜表面形成一層聚多巴胺（記為PI/DOPA）。將PI/DOPA片浸入STAC溶液（0.1%，w/V）中靜置5 s后，迅速轉(zhuǎn)移到鉑納米溶膠[8]中，1 min后取出晾干，使PI/DOPA表面靜電吸附一層隨機(jī)分布的鉑納米顆粒；然后浸入鍍金液（含10 mmol/L氯金酸與20 mmol/L過氧化氫）進(jìn)行化學(xué)沉積，5 min后取出并在200℃烘箱中退火5 min，使聚酰亞胺薄膜表面形成一層光亮致密的金層（記為PI/Au）。

2.3 傳感器制備

設(shè)定工作區(qū)域?yàn)? mm，引線部分為1 cm，其余部分為絕緣區(qū)域（3.5 cm），在PI/Au兩面設(shè)定的絕緣區(qū)域氣相沉積Parylene（記為PI/Au/Parylene）。然后以Pt片為對(duì)電極，用恒電位法，設(shè)定工作電位

Symbolm@@ 2.5 V，沉積時(shí)間120 s，在設(shè)定的工作區(qū)域電沉積鉑黑層（記為PtPt），其中，鍍鉑液為3%（w/V）氯鉑酸和0.25%（w/V）醋酸鉛的混合溶液；接著，在CNT/Nafion混合溶液（1∶4， V/V）中，以R面作為對(duì)電極，W面為工作電極，用恒電位法，設(shè)定工作電壓為1.0 V，工作時(shí)間90 s，在W面上電泳吸附CNT，形成以CNT為骨架的Nafion網(wǎng)絡(luò)層（記為Pt/CNTPt）。然后，同樣用恒電位法，設(shè)定工作電壓為0.7 V，工作時(shí)間20 min，在GOD溶液（含10wt%的BSA）中，將GOD電吸附于W面，接著在4℃冰箱中干燥8 h，使GOD充分嵌入到CNT網(wǎng)絡(luò)層內(nèi).然后，在40℃烘箱中，將W面懸掛于底部含25%戊二醛的密封腔中進(jìn)行交聯(lián)，40 min后取出并置于4℃冰箱中保存8 h，使酶層充分交聯(lián)固化（記為Pt/CNT/GOxPt）。然后用激光切割機(jī)將薄膜切割成0.5 mm×4 cm的細(xì)針狀，其中工作區(qū)域?yàn)?.5 mm×5 mm。最后，讓針型傳感器的工作區(qū)域緩緩穿過沾有4%（w/V）PU溶液（THFDMF，98∶2， V/V）的鋼絲圈（=2 mm），在其表面形成一層多孔保護(hù)膜。涂膜后的傳感器在干燥箱中干燥8 h后，在PBS溶液中浸泡72 h，使傳感器各層充分調(diào)控融合。制備的傳感器放在4℃保存?zhèn)溆谩鞲衅髦苽涫疽鈭D如圖1所示。

2.4 葡萄糖連續(xù)響應(yīng)測(cè)試

測(cè)試在CHI660E電化學(xué)工作站上進(jìn)行，采用計(jì)時(shí)電流 （it） 法進(jìn)行葡萄糖連續(xù)響應(yīng)測(cè)試。設(shè)定工作電位0.3 V，磁子轉(zhuǎn)速200 r/min，檢測(cè)池內(nèi)PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）溫度37℃。上電初始化40 min后，每隔5 min，向檢測(cè)池中注射適量濃度葡萄糖溶液，使檢測(cè)池中的葡萄糖濃度按4 mmol/L的梯度遞增。

3 結(jié)果與討論

3.1 傳感器各層表面形態(tài)表征

利用掃描電鏡觀察各層表面形態(tài)。圖2a是PI鍍金薄膜橫切面，金層厚約10 μm，與PI表面緊密結(jié)合。圖2b是鍍金層表面，可觀察到整齊、緊致、均勻分布的金納米顆粒。圖2c是鉑催化層，鉑納米顆粒呈花瓣?duì)?，單個(gè)花瓣平均長度400～500 nm，平均寬度150～250 nm。圖2d是Nafion/CNT多孔網(wǎng)絡(luò)層，可見Nafion以CNT為骨架，呈多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)狀。圖2e是葡萄糖氧化酶層，可看到GOx嵌入并覆蓋Nafton/CNT網(wǎng)孔，形成一層多孔、厚實(shí)的酶層。圖2f為PU外膜層，其中，PU呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布范圍為2～4 μm。

3.2 傳感器對(duì)葡萄糖的響應(yīng)性能

傳感器對(duì)葡萄糖的連續(xù)響應(yīng)測(cè)試如圖3所示，在最優(yōu)條件下，傳感器對(duì)葡萄糖響應(yīng)的線性范圍為2.0～32.0 mmol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.98（圖3左上插圖），響應(yīng)靈敏度為25 μA·（mmol/L）

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Symbolm@@ 2，檢出限為0.05 mmol/L（S/N=3）。如此高的響應(yīng)靈敏度一方面得益于催化層中花瓣?duì)畹你K納米顆粒對(duì)H2O2有極強(qiáng)的電化學(xué)催化能力[10]，使酶層催化葡萄糖反應(yīng)生成的H2O2迅速分解，從而產(chǎn)生較強(qiáng)響應(yīng)電流；另一方面，鉑納米花層大大增加了電極的比表面積，從而產(chǎn)生更大的響應(yīng)電流。

本傳感器具有較快的響應(yīng)速度，以葡萄糖濃度從8 mmol/L到12 mmol/L變化時(shí)為例，從注射高濃度葡萄糖至達(dá)到90%穩(wěn)態(tài)響應(yīng)值的用時(shí)24 s（圖3右下插圖），30 s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)響應(yīng)值?？紤]到每次從注射葡萄糖到檢測(cè)池濃度達(dá)到均衡所花費(fèi)時(shí)間的影響，單次濃度梯度變化的響應(yīng)時(shí)間在25～35 s內(nèi)?？焖俚捻憫?yīng)速度既取決于Pt催化層對(duì)H2O2的快速響應(yīng)能力，也取決于單層雙面的傳感器電極結(jié)構(gòu)。工作電極與參比/對(duì)電極之間僅間隔一層PI膜，厚度僅127 μm，電極間如此近的距離，縮小了以O(shè)2擴(kuò)散完成電子傳遞的距離，從而加快電子傳遞速度，獲得較快的響應(yīng)速度。然而，較小的電極間隙，也帶來了電子在兩極之間來回穿梭而形成的穿梭電流對(duì)響應(yīng)的影響[3]，尤其是在較高的濃度梯度下，穿梭電流帶來了較大的背景噪聲。

3.3 一致性測(cè)試

隨機(jī)挑選同一片PI膜經(jīng)激光切割后的8根傳感器，對(duì)比其涂覆PU膜前后，傳感器的線性響應(yīng)范圍，如圖4所示。從圖4a可見，經(jīng)激光切割后，傳感器的批量一致性好，但受酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)的限制，其線性響應(yīng)范圍小。經(jīng)手工涂覆PU膜后，在PU傳質(zhì)限制膜的作用下，傳感器的線性范圍明顯擴(kuò)大，但由于實(shí)驗(yàn)條件限制，用手工完成涂膜，涂膜操作的速度，周邊環(huán)境溫濕度的輕微變化都可能影響成膜的效果，因此，出現(xiàn)了涂膜后傳感器一致性變差的情況，如圖4b所示。

3.4 抗干擾實(shí)驗(yàn)

對(duì)電活性物質(zhì)的抗干擾性是決定葡萄糖傳感器準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)，為能直接考察傳感器的抗干擾特性，對(duì)未涂PU傳質(zhì)限制層的傳感器進(jìn)行連續(xù)梯度測(cè)試。如圖5所示，本傳感器對(duì)尿酸（UA）、抗壞血酸（AA）、醋氨酚（AP）都有良好的抗干擾性，這是由于Nafion/CNT網(wǎng)絡(luò)多孔內(nèi)層，對(duì)傳感器的抗干擾性起到積極的作用[11]，另一方面，本傳感器工作電位低（0.3 V），大大降低了電極對(duì)抗壞血酸等電活性物質(zhì)的響應(yīng)，進(jìn)一步提高了傳感器的抗干擾性。

3.5 PU膜生物兼容性實(shí)驗(yàn)

植入皮下工作的葡萄糖傳感器靈敏度會(huì)隨著酶活性的下降， 傳感器表面的蛋白吸附而下降。對(duì)涂有PU膜的傳感器進(jìn)行仿生理環(huán)境的體外測(cè)試結(jié)果如圖6所示。在37℃水浴環(huán)境下，將傳感器浸入胎牛血清中長期浸泡后，每隔一定時(shí)間取出進(jìn)行葡萄糖連續(xù)響應(yīng)測(cè)試，結(jié)果表明，浸泡3 d后，傳感器的連續(xù)梯度響應(yīng)性能比剛涂覆過PU膜的傳感器性能略有提升，這是由于外層PU膜在連續(xù)浸泡后，傳感器各層之間的調(diào)控更加連續(xù)一致。但浸泡15 d后，對(duì)36 mmol/L濃度時(shí)的最大響應(yīng)電流約降為初始值的75%；浸泡30 d后，約降為初始值的65%。這可能是由于隨著傳感器長期在胎牛血清中的浸泡，PU表面多孔結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)緩慢降解，促使蛋白吸附量逐漸增加，減少了傳感器的有效面積所致。但此時(shí)的靈敏度仍達(dá)10 μA·（mmol/L）

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Symbolm@@ 2，可以滿足連續(xù)監(jiān)測(cè)的要求。

4 結(jié) 論

以表面化學(xué)鍍金的PI薄膜為基體電極，成功制備了一種柔性細(xì)針狀葡萄糖傳感器，本傳感器在2.0～32.0 mmol/L的線性響應(yīng)范圍內(nèi)，靈敏度為25 μA·cm

Symbolm@@ 2·（mmol/L）

Symbolm@@ 1，在胎牛血清中連續(xù)浸泡30 d，響應(yīng)信號(hào)約為初始狀態(tài)的65%，適用于皮下連續(xù)葡萄糖監(jiān)測(cè)。本傳感器制備采用激光切割成型，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，后期可改進(jìn)PU涂膜方式為機(jī)涂，提高傳感器批量生產(chǎn)的一致性。

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