基于間接競爭原理的流式微球技術快速檢測麥芽中赭曲霉毒素A

肖昌彬 劉秋桃 豆小文 楊美華 孔維軍 萬麗

摘 要 建立了一種快速、靈敏檢測中藥麥芽中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A， OTA）含量的間接競爭流式微球方法。麥芽樣品經60%甲醇/PBS提取，加入20%甲醇/PBS溶液稀釋5倍后，離心取上清液制備樣品。在編碼熒光微球上偶聯(lián)牛血清白蛋白OTA（BSAOTA）復合物，與樣品中OTA競爭結合抗OTA特異性抗體，然后加入FITCIgG孵育，離心洗滌后，用流式細胞儀檢測微球表面的平均熒光強度，實現(xiàn)樣品中OTA的準確定性定量測定。本方法檢測OTA的半數(shù)抑制濃度IC50為1.20 ng/mL，相關系數(shù)R2=0.9892，檢出限（IC10）為0.12 ng/mL， 加樣回收率為93.9%～97.4%，RSD<3.6%。16份實際麥芽樣品中檢測到2個陽性樣品，OTA的最高含量為3.83

SymbolmA@ g/kg，未超出歐盟的OTA限量標準，與液相色譜串聯(lián)質譜（LCMS/MS）法檢測結果相一致。本方法簡單、快速、靈敏、可靠，可拓展用于其它復雜基質中多種真菌毒素的定性與定量檢測。

關鍵詞 流式微球技術；間接競爭；麥芽；赭曲霉毒素A；快速檢測

1 引 言

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A， OTA）是由曲霉屬和青霉屬真菌產生的有毒次生代謝產物[1]，具有嚴重的致癌、致畸、致突變及肝細胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等毒性作用[2]，已被國際癌癥研究機構[3]列為人類可能的致癌物（2B級），也被美國國家毒理學計劃[4]定為極有可能對人類產生致癌性的物質。OTA是食品、農產品及農作物、藥用植物中主要的外源性有害污染物，不僅會影響相關產品的質量，而且對人類健康和生命安全存在潛在的威脅[5，6]。世界各國已對其制定了嚴格的限量標準，如歐盟聯(lián)合委員會規(guī)定谷物中OTA的限量為5.0 μg/kg，谷物制品及其相關產品中OTA的限量為3.0 μg/kg，酒和葡萄汁飲料中OTA的限量為2.0 μg/L[ 7]。因此，開發(fā)簡單、快速、準確、靈敏且特異性的檢測方法，對于保證食品、農產品及藥用植物的安全使用以及保證人類健康至關重要[8]。

OTA的檢測大多采用儀器分析技術[9～11]，如液相色譜熒光法（HPLCFLD）及串聯(lián)質譜法（LCMS/MS）等。雖然這些分析方法具有靈敏、準確的特點，但需大型的昂貴的儀器，操作步驟繁瑣、耗時；此外，食品、農產品、中藥材等基質成分復雜，需要嚴格的前處理和凈化步驟，給實際操作帶來諸多困難。酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）以其高特異性、高選擇性、對樣品純度要求不高及樣品處理量大的優(yōu)點，而被用于復雜基質中OTA的快速篩查檢測[12，13]，但存在靈敏度低、重復性差等不足[14]。

流式微球技術（Cytometric bead array， CBA）[15～20]以一系列熒光強度不同的編碼微球為載體，通過激光束激發(fā)熒光編碼微球，利用流式細胞儀分析微球本身和表面熒光強度完成數(shù)據收集和分析，可實現(xiàn)復雜基質中目標物靈敏、準確的快速檢測，且重復性和穩(wěn)定性好、分析時間短、假陽率低。該技術已被應用到多種基質中大分子及小分子化合物的高通量檢測[21～25]。OTA為小分子化合物，具有半抗原性、分子量小、單一抗原表位、本身不具免疫原性等特點[26]，多采用基于“抗體抗原”特異性識別的競爭型流式微球免疫分析技術，而間接競爭模式因其偶聯(lián)過程中不損傷，且不阻礙抗體與抗原的識別位點等優(yōu)勢被廣泛應用[27，28]。

麥芽為中醫(yī)臨床常用的中藥材，具有行氣消食、健脾開胃、退乳消腫[29]等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，麥芽還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抑制膽固醇與血脂增加、預防心血管疾病、增強免疫能力等作用[30]。麥芽還是糧食、飼料和釀酒的重要原料。麥芽的制備加工過程中[31]，極易霉變變質產生真菌毒素如OTA等。所以，有必要建立適合麥芽中OTA的現(xiàn)場、靈敏、高效的檢測方法[32，33]。

本研究建立了一種基于間接競爭模式的流式微球方法，在熒光微球表面偶聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）OTA復合物，與樣品中OTA共同競爭特異性抗體，加入熒光標記的二抗探針后，通過流式細胞儀檢測微球本體和表面熒光，實現(xiàn)OTA的定性定量測定。本方法操作簡單、檢測通量大、檢出限低、靈敏度高、特異性好、受基質干擾小，可推廣用于中藥材等復雜基質中其它真菌毒素的分析和檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

BD FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）；液相色譜串聯(lián)質譜系統(tǒng)： LC20AD XR液相色譜儀（日本島津公司），5500 QTRAP質譜儀（美國AB SCIEX公司）；TUS200P恒溫振蕩金屬?。ㄉ虾Ｒ缓愎荆?；KQ500超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ANKE TGL16C高速離心機（上海安亭公司）；AB135S電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；pH計（德國Sartorius公司）

羧基化紅色熒光微球FC05F（Φ 4.95 μm，激發(fā)波長630 nm，發(fā)射波長690 nm）購自美國Bangs Laboratories公司；OTA對照品（濃度為1.0 mg/mL）購于新加坡Pribolab公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）購自SigmaAldrich公司；OTA牛血清白蛋白（BSAOTA，7.8 mg/mL）、OTA單克隆抗體（mAb，7.2 mg/mL）購自山東綠都生物工程有限公司；異硫氰酸熒光素標記羊抗小鼠二抗（Fluorescein isothiocyanate （FITC） labeled goat antimouse IgG（H+L），1.5 mg/mL）購自美國Fitzgerald公司；嗎啉乙磺酸（MES）、N羥基琥珀酰亞胺鹽酸鹽（NHS）、碳化二亞胺（EDC）購自美國Sigma公司；其它試劑均為分析純。

2.2 緩沖液的配制

10 mmol/L PBS（pH=7.4）： NaCl 8.0 g、Na2HPO4 1.2 g、KH2PO4 0.2 g、KCl 0.2 g加蒸餾水溶解并定容至1000 mL；封閉液： PBSBT（pH 7.4，含1% BSA和0.1% Tween20）；洗滌緩沖液： PBST（pH 7.4，含0.1% Tween20）；保存緩沖液： PBSBTN（pH 7.4，含0.1 % BSA、0.01% Tween20和 0.05% NaN3）；活化緩沖液： 50 mmol/L MES（pH 5.0）；偶聯(lián)緩沖液： 50 mmol/L MES（pH6.0）；偶聯(lián)劑： 0.32 mol/L EDC、 0.33 mol/L NHS；樣品提取液： 甲醇PBS（60∶40， V/V）；樣品稀釋液： 甲醇PBS（20∶80， V/V），均用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH調節(jié)pH值，溶液在使用前均用0.22 μm濾膜過濾。

2.3 羧基熒光微球偶聯(lián)BSAOTA

根據Bangs laboratories（TechNote 205 Covalent Coupling）提供的方案制備微球偶聯(lián)BSAOTA免疫分析物。取10 μL（約1.433×106個）熒光微球于2 mL離心管中，加入200 μL 活化緩沖液振蕩30 s，充分混勻后靜置5 min，14000 r/min離心15 min，棄上清液。微球用活化緩沖液清洗2次后，加入160 μL偶聯(lián)緩沖液、20 μL EDC、20 μL NHS，于恒溫振蕩， 金屬浴中孵育（25℃，600 r/min）30 min，14000 r/min離心15 min，棄去上清液；加入200 μL偶聯(lián)緩沖液及BSAOTA蛋白偶聯(lián)物，充分混勻后恒溫振蕩金屬浴上孵育2 h，14000 r/min離心15 min，棄去上清液。微球清洗2次，加入500 μL封閉液，再于恒溫振蕩金屬浴中孵育2 h。離心棄去上清液，偶聯(lián)好的微球用緩沖液清洗2次，加入1 mL保存緩沖液于4℃儲藏備用。分別取1， 2， 4， 8， 10， 20和30 μL偶聯(lián)BSAOTA的微球，加入200 μL PBS混勻，流式細胞儀檢測。偶聯(lián)微球制備及檢測過程，均在避光條件下進行。

2.4 樣品及標準品溶液的制備

稱取麥芽粗粉（過2號篩）1 g于10 mL 離心管中，加入2 mL樣品提取液，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，12000 r/min離心10 min，吸取上清液過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜。濾液稀釋5倍后，14000 r/min離心10 min，取上清液備用。

取適量1.0 mg/mL OTA甲醇儲備液，加入陰性樣品提取液，制備0， 0.001， 0.01， 0.098， 0.391， 1.56， 6.25， 25和100 ng/ mL的基質匹配OTA標準溶液。

2.5 樣品中OTA的檢測

取100 μL不同濃度的基質匹配標準品或樣品溶液，加入100 μL 50 ng/mL抗體孵育20 min，加入10 μL偶聯(lián)BSAOTA微球孵育40 min，離心去上清液；微球清洗2次，加入1∶4000倍稀釋的FITCIgG熒光二抗孵育1 h，離心，用緩沖液清洗2次，加入200 μL PBS振蕩混勻后用流式細胞儀檢測。檢測時，635 nm激光激發(fā)微球本體熒光，在流式細胞儀的APC熒光值通道檢測；488 nm激光激發(fā)微球表面結合的FITCIgG熒光，在流式細胞儀的FITC熒光值通道檢測。收集2000個微球的檢測信號，約90 s后結束檢測，每個樣品平行制備3份檢測樣品進行平行檢測，分析微球表面的平均熒光強度（Mean fluorescence intensity，MFI），對樣品中OTA進行定量分析[33]。

2.6 數(shù)據分析

3.1.6 鹽離子濃度的影響 考察了PBS溶液中的鹽離子濃度（以HPO2-4和H2PO-4計）對檢測結果的影響。由圖1e可見，隨著PBS溶液中鹽離子濃度的增加，微球表面的熒光值逐漸增強，當鹽離子濃度為0.01 mol/L時達到最大；隨鹽離子濃度繼續(xù)升高，熒光強度降低；當鹽離子濃度為0.1 mol/L時，微球表面的熒光值幾乎為0，說明此時抗體已經變性或者高濃度的鹽致使微球變形、溶解。最終確定最適鹽離子濃度為0.01 mol/L。

3.1.7 甲醇濃度的影響 麥芽樣品經60%甲醇/PBS溶劑提取，但60%甲醇濃度易使抗體變性失活，樣品提取液需經稀釋后才能用于流式微球免疫分析。由圖1f可見，隨著甲醇濃度的升高，微球表面的熒光強度逐漸增強，當甲醇濃度達到30%時，微球表面熒光值最強；隨著甲醇濃度的繼續(xù)增加，熒光強度急劇降低。考慮到提取溶液中甲醇的存在，最終選擇20%甲醇PBS對樣品提取液和標準品溶液進行稀釋，然后進樣分析。

3.1.8 基質成分對流式微球免疫分析的影響

如圖1g所示，樣品基質液稀釋倍數(shù)越多，基質成分對微球表面的熒光值影響越小。但稀釋倍數(shù)越大，達不到方法的靈敏度和檢出限要求。因此選擇樣品提取液稀釋5倍后，進行檢測以及基質加標實驗。

3.2 非特異性吸附的考察

在流式細胞儀檢測過程中，流式編碼熒光微球在鞘液流中分布不均一發(fā)生粘連或非特異性吸附，均會影響流式細胞儀對微球表面熒光強度的檢測。微球在APC通道的熒光峰出現(xiàn)峰高鈍化或者肩峰，表明微球發(fā)生粘連，在溶液中分布不均一；在FITC通道的熒光峰出現(xiàn)峰形低、峰位變寬、峰形分叉，表明微球表面存在非特異性吸附。實驗表明， 微球表面的平均熒光強度與背景干擾熒光值相當，

圖2 緩沖液和麥芽樣品提取液的競爭抑制校正曲線（n=3）

Fig.2 Calibration curves for inhibition immunoassay in buffer and malt extract （n=3）說明偶聯(lián)BSAOTA微球表面的非特異性吸附量很少。

3.3 競爭抑制曲線的建立

標準品經樣品稀釋液或基質稀釋液稀釋成不同濃度后在優(yōu)化的條件下進行檢測，繪制競爭抑制曲線，計算方法的檢出限、線性范圍（IC10～IC90）及IC50值。由圖2和表2可以看出，樣品稀釋液與基質稀釋液對間接競爭的流式微球分析法影響較小，麥芽基質液對微球、抗體及微球表面的熒光強度淬滅少，對方法的靈敏度影響小。但抗原抗體之間的免疫反應受諸多實驗因素的影響，因此選用基質校正曲線作為測定麥芽中OTA的標準競爭抑制曲線， 以減少誤差。

3.6 麥芽實際樣品中OTA的檢測

采用建立的間接競爭模式的流式微球分析方法檢測16批不同地點購買的麥芽樣品中OTA的含量。在2批樣品中檢測到OTA，陽性樣品發(fā)生率為12.5%，但OTA的含量（3.36和3.83 μg/kg）均未超出歐盟聯(lián)合委員會（European Commission）對OTA的限量標準（5 μg/kg）。同時采用液相色譜串聯(lián)質譜對上述樣品進行檢測，采用OTA離子對m/z 404.2→358及m/z 404.2→239.1及保留時間來對陽性樣品進行確證， 兩種方法檢測結果一致。上述結果證明建立的流式微球技術可用于復雜基質麥芽樣品中OTA的定性與定量分析，并可拓展用于其它復雜基質中更多真菌毒素的快速、靈敏檢測。

4 結 論

建立了簡單、快速、靈敏、準確的定性定量分析麥芽中OTA的間接競爭流式微球分析方法，考察了FITCIgG稀釋倍數(shù)、孵育時間、溫度、pH值、基質效應等條件對檢測結果的影響，優(yōu)化了反應條件。流式微球技術以羧基化熒光編碼微球為載體，具有體積小、比表面積大、高擴散性、粒徑及形態(tài)均一、熒光強度高的特點，檢測靈敏度高，但聚苯乙烯微球比重輕，不易沉降，離心時微球易損失，清洗及離心過程耗時長，不利于快速檢測?？梢岳敏然鶡晒獯判晕⑶?，借助磁性分離，以減少微球損失，節(jié)約時間，且洗滌充分，以提高方法的靈敏度?；陂g接競爭模式的流式微球分析檢測技術，檢測通量大、檢出限低、分析速度快，適于中藥復雜基質體系中痕量小分子物質的檢測。麥芽樣品只需60%甲醇/PBS簡單提取、5倍稀釋并孵育后即可上樣檢測，不需要額外的前處理步驟，提高了樣品的提取效率，減少了樣品處理過程中待測目標物真菌毒素的損失，對實際麥芽樣品的檢測結果與LCMS/MS檢測結果一致。本研究運用流式微球技術快速檢測麥芽中的OTA，為中藥材質量監(jiān)控提供了科學、有效的分析手段。

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